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球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是广泛用于农林害虫生物防治的昆虫病原真菌。研究揭示昆虫病原真菌生防潜能相关性状的遗传背景、调控机理并应用于指导生防潜能的遗传改良和高效菌剂的研发，是后基因组时代的重要研究方向。球孢白僵菌在穿透昆虫体壁过程中需要分泌多种体壁降解酶，包括碱性胞外蛋白酶Pr1，其结构和功能类似于枯草杆菌蛋白酶，故亦称类枯草杆菌蛋白酶(substilisin-like Pr1 proteases)。Pr1家族由多个分泌型类枯草杆菌蛋白酶组成，在菌丝侵入昆虫体内过程中发挥降解体壁的作用，因而是昆虫体壁降解酶类之一，通常被认为是具有重要利用价值的毒力因子。然而，Pr1家族成员在昆虫病原真菌中的真正作用迄今知之十分有限。作为昆虫寄主范围最广的致病菌，球孢白僵菌早在2亿年前就进化获得了昆虫致病性，比绿僵菌早1.3亿年。本研究通过比对分析球孢白僵菌中11种Pr1蛋白酶的分子特征和生物学功能，辨析在宿主菌侵染过程中扮演必要和不必要角色的Pr1家族成员，由此揭示作为昆虫病原真菌致病性进化的保守分子标记。主要研究内容和结果概述如下：
球孢白僵菌Pr1家族11个成员都有一个由15~20个氨基酸组成的N端信号肽，分为Ⅰ类和Ⅱ类，后者含两个亚族(SF1/2)。其中，Ⅱ类有10个成员，共有一个肽酶S8家族结构域(cd04077)，而Ⅰ类仅有唯一成员Pr1C，除带有类似cd04077的大结构域之外，还带有蛋白酶相关结构域(PA_PoS1_like)和fn3_5结构域(fn3-like)。基于系统发育关系、分子特征及序列一致性的分析，球孢白僵菌中11种Pr1蛋白酶与金龟子绿僵菌复合种(Metarhizium anisopliae complex)中先前命名的11种同源蛋白(Pr1A~K)有同有异。据此，球孢白僵菌的11种Pr1蛋白酶分别重新命名为Pr1A1/2(SF1)、Pr1B1~3(SF1)、Pr1C(Ⅰ类)、Pr1F1~4(SF2)及Pr1G(SF1)，即绿僵菌的Pr1A、Pr1B和Pr1F在白僵菌中分别有二、三和四个旁系同源蛋白，但白僵菌中不存在绿僵菌Pr1D、Pr1E、Pr1H、Pr1I、Pr1J及Pr1K的同源蛋白。
将各pr1基因缺失突变株、回补株及野生株在培养液中培养30h测定各pr1基因的转录水平，显示每个pr1基因的缺失都会导致部分正常pr1基因的表达不同程度的显著上调或下调，说明Pr1家族成员之间存在转录互作或互补的关系。从上述培养物的上清液中测定各菌株的胞外Pr1总酶活，发现野生株的Pr1总酶活在△pr1A2中下降70%，在△pr1C中下降66%，在△pr1B2中下降63%，在△pr1G中下降60%，在△pr1B1中下降48%，在△pr1A1中下降25%，但在△pr1B3和4个△pr1F缺失株中无显著变化。然而，无论生物量还是细胞内Pr1总酶活，各敲除株与野生株及回补株之间均无显著差异。在以蝗虫体壁粉末为营养的培养液中培养24h和36h时测定各菌株的胞外Pr1总酶活，结果与上述测定结果相似，但在△pr1A1中无显著变化。结果表明，Ⅰ类Pr1C和四个Ⅱ类SF1成员Pr1A2、Pr1B1、Pr1B2及Pr1G是球孢白僵菌侵染过程中必需的昆虫体壁降解酶，而其余六个Ⅱ类成员对总酶活没有显著贡献。
分生孢子在平板上的萌发速度在所有菌株中无显著差异，在蝗虫后翅上的萌发仅在△pr1A2和△pr1B2中有轻微加快。在标准培养基平板上的生物量和分生孢子产量以及对高渗、氧化、胞壁干扰及热激胁迫下生长的菌落大小，在所有敲除株与对照菌株之间也无任何显著差异。在标准化生物测定中，对大蜡螟5龄幼虫用107个孢子/ml的悬液浸渍接种的体壁侵染，导致幼虫死亡50%所需时间(LT50)在△pr1C、△pr1B2、△pr1A2、△pr1G及?△pr1B1中较野生株分别显著延长29%、28%、27%、20%和19%，而其余?pr1敲除株与对照菌株的LT50均无显著差异。在每头幼虫直接血腔注射500个孢子的生测中，LT50在各敲除株与对照菌株之间均无显著差异。经体壁侵染的LT50显著延长的上述5个△pr1敲除株，各自在寄主血腔中的增殖明显迟缓。在感染72h和96h时，这些敲除株在存活幼虫血样中的芽生孢子浓度分别较野生株降低79~88%和42~63%。在试虫死亡后三天内，上述5个毒力减弱的△pr1敲除株从虫尸体内穿透体壁长出体表的速度明显慢于对照菌株，以致于在死后第8天虫尸体表的分生孢子产量较对照菌株下降21~54%。对所有菌株的上述主要表型数据进行线性回归分析显示，胞外Pr1总酶活水平与体壁感染的LT50或虫尸体表的分生孢子产量之间存在显著的负相关(r2=0.86)或正相关(r2=0.82)，LT50与感染后4天时血样中芽生孢子浓度之间也存在显著的负相关(r2=0.89)。
所有结果表明，Pr1C、Pr1A2、Pr1B1、Pr1B2及Pr1G对球孢白僵菌穿透昆虫体壁的侵入过程具有显著贡献，虽然各自对毒力的贡献有限(仅25%左右)，但集体而言是昆虫致病性不可缺的，因而可视为维持球孢白僵菌广谱致病性的保守分子标记，但它们并不参与生长发育或侵染后毒力相关的细胞生物学过程。其余6个Ⅱ类成员(Pr1A1、Pr1B3及Pr1F1~4)未发现有实质性功能，可能是球孢白僵菌的进化冗余。
球孢白僵菌Pr1家族11个成员都有一个由15~20个氨基酸组成的N端信号肽，分为Ⅰ类和Ⅱ类，后者含两个亚族(SF1/2)。其中，Ⅱ类有10个成员，共有一个肽酶S8家族结构域(cd04077)，而Ⅰ类仅有唯一成员Pr1C，除带有类似cd04077的大结构域之外，还带有蛋白酶相关结构域(PA_PoS1_like)和fn3_5结构域(fn3-like)。基于系统发育关系、分子特征及序列一致性的分析，球孢白僵菌中11种Pr1蛋白酶与金龟子绿僵菌复合种(Metarhizium anisopliae complex)中先前命名的11种同源蛋白(Pr1A~K)有同有异。据此，球孢白僵菌的11种Pr1蛋白酶分别重新命名为Pr1A1/2(SF1)、Pr1B1~3(SF1)、Pr1C(Ⅰ类)、Pr1F1~4(SF2)及Pr1G(SF1)，即绿僵菌的Pr1A、Pr1B和Pr1F在白僵菌中分别有二、三和四个旁系同源蛋白，但白僵菌中不存在绿僵菌Pr1D、Pr1E、Pr1H、Pr1I、Pr1J及Pr1K的同源蛋白。
将各pr1基因缺失突变株、回补株及野生株在培养液中培养30h测定各pr1基因的转录水平，显示每个pr1基因的缺失都会导致部分正常pr1基因的表达不同程度的显著上调或下调，说明Pr1家族成员之间存在转录互作或互补的关系。从上述培养物的上清液中测定各菌株的胞外Pr1总酶活，发现野生株的Pr1总酶活在△pr1A2中下降70%，在△pr1C中下降66%，在△pr1B2中下降63%，在△pr1G中下降60%，在△pr1B1中下降48%，在△pr1A1中下降25%，但在△pr1B3和4个△pr1F缺失株中无显著变化。然而，无论生物量还是细胞内Pr1总酶活，各敲除株与野生株及回补株之间均无显著差异。在以蝗虫体壁粉末为营养的培养液中培养24h和36h时测定各菌株的胞外Pr1总酶活，结果与上述测定结果相似，但在△pr1A1中无显著变化。结果表明，Ⅰ类Pr1C和四个Ⅱ类SF1成员Pr1A2、Pr1B1、Pr1B2及Pr1G是球孢白僵菌侵染过程中必需的昆虫体壁降解酶，而其余六个Ⅱ类成员对总酶活没有显著贡献。
分生孢子在平板上的萌发速度在所有菌株中无显著差异，在蝗虫后翅上的萌发仅在△pr1A2和△pr1B2中有轻微加快。在标准培养基平板上的生物量和分生孢子产量以及对高渗、氧化、胞壁干扰及热激胁迫下生长的菌落大小，在所有敲除株与对照菌株之间也无任何显著差异。在标准化生物测定中，对大蜡螟5龄幼虫用107个孢子/ml的悬液浸渍接种的体壁侵染，导致幼虫死亡50%所需时间(LT50)在△pr1C、△pr1B2、△pr1A2、△pr1G及?△pr1B1中较野生株分别显著延长29%、28%、27%、20%和19%，而其余?pr1敲除株与对照菌株的LT50均无显著差异。在每头幼虫直接血腔注射500个孢子的生测中，LT50在各敲除株与对照菌株之间均无显著差异。经体壁侵染的LT50显著延长的上述5个△pr1敲除株，各自在寄主血腔中的增殖明显迟缓。在感染72h和96h时，这些敲除株在存活幼虫血样中的芽生孢子浓度分别较野生株降低79~88%和42~63%。在试虫死亡后三天内，上述5个毒力减弱的△pr1敲除株从虫尸体内穿透体壁长出体表的速度明显慢于对照菌株，以致于在死后第8天虫尸体表的分生孢子产量较对照菌株下降21~54%。对所有菌株的上述主要表型数据进行线性回归分析显示，胞外Pr1总酶活水平与体壁感染的LT50或虫尸体表的分生孢子产量之间存在显著的负相关(r2=0.86)或正相关(r2=0.82)，LT50与感染后4天时血样中芽生孢子浓度之间也存在显著的负相关(r2=0.89)。
所有结果表明，Pr1C、Pr1A2、Pr1B1、Pr1B2及Pr1G对球孢白僵菌穿透昆虫体壁的侵入过程具有显著贡献，虽然各自对毒力的贡献有限(仅25%左右)，但集体而言是昆虫致病性不可缺的，因而可视为维持球孢白僵菌广谱致病性的保守分子标记，但它们并不参与生长发育或侵染后毒力相关的细胞生物学过程。其余6个Ⅱ类成员(Pr1A1、Pr1B3及Pr1F1~4)未发现有实质性功能，可能是球孢白僵菌的进化冗余。