论文部分内容阅读
探索安全有效、简便易行的非缺血预处理措施,是脑保护领域研究的热点之一。我们实验室首先发现在大鼠短暂局灶性脑缺血模型中给予电针刺激“百会穴”预处理,可诱导产生快速相和延迟相脑缺血耐受效应,产生脑保护作用,且具有最佳组合参数和穴位特异性【1,2】。随后研究发现,阿片δ和μ受体参与电针预处理诱导的脑保护效应,应用δ和μ受体拮抗剂并不能完全阻断电针预处理的脑保护作用,提示其保护作用可能还由其它活性物质参与或多条信号通路介导。研究表明,大麻素CB1受体的激动剂具有脑保护作用,并且阿片肽受体和CB1受体具有协同和交互作用,提示大麻素CB1受体可能参与了电针预处理诱导的脑保护作用。同时有证据显示针灸产生的神经保护作用,可能还与抑制胶质细胞过度活化和抗炎反应有关【3】。胶质细胞在脑缺血后活化,释放出炎症介质,诱导炎症反应,造成神经元的二次损伤。由于炎症反应主要在缺血后晚期造成脑损伤,故抑制缺血后胶质细胞过度活化,减轻炎症反应可以在缺血后晚期发挥脑保护作用。且研究发现小胶质细胞和星形胶质细胞均有CB2受体表达【4】,激活CB2受体可以调控胶质细胞活化,具有抗炎和神经保护作用【5,6】。由此我们推测,电针预处理诱导大麻素受体的激活从而参与了电针预处理诱导的脑缺血耐受效应。因此本研究拟从电针预处理诱导的快速相和延迟相脑保护入手,研究大麻素CB1和CB2受体在电针预处理诱导的两个时相脑保护中各自的作用。第一部分大麻素受体在电针预处理诱导的快速相脑保护中的作用方法1观察电针预处理后大鼠脑内大麻素受体表达的变化成年雄性SD大鼠(280-320g)42只,按随机数字表法分为3组:CON组、SP组和EA组。CON组:无任何处理;SP组:戊巴比妥钠(40 mg/kg,i.p.)麻醉;EA组:腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后电针刺激“百会穴”,选用疏密波、频率2/15 Hz、电流强度1 mA,持续刺激30min,处理1次。分别在电针预处理后30min、60min和120min,取大鼠右侧半脑纹状体行RT-PCR和Western blot检测大麻素CB1和CB2受体水平。2研究大麻素受体在电针预处理诱导的快速相脑保护中的作用成年雄性SD大鼠(280-320g)56只,按随机数字表法分为7组(n=8):Sham组、MCAO组、EA组、Vehicle+EA组、AM630+EA组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组。Sham组仅行假手术;MCAO组为大脑中动脉阻塞再灌注;EA组在MCAO前2 h给予电针刺激“百会穴”30min;Vehicle+EA组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组在电针预处理前30min分别给予溶剂3ml/kg(ip)和AM251 1mg/kg(ip);AM630+EA组和AM630+AM251+EA组在电针预处理前3h分别给予溶剂3ml/kg(ip)和AM630 1mg/kg(ip)。除Sham组外其余各组均在电针预处理后2h行MCAO,缺血120min再灌注后72 h行神经功能学评分和TTC染色,检测脑梗死容积百分比的变化。结果1电针预处理后大鼠脑内大麻素CB1和CB2受体表达的变化1.1大麻素CB1受体mRNA表达的变化与CON组和SP组相比,电针预处理后30min和60min,CB1受体mRNA的表达显著增高(P<0.01);电针预处理后120min其含量降至CON组水平。1.2大麻素CB1受体蛋白表达的变化Western blot结果显示,与CON组和SP组相比,电针预处理后30min和60min,CB1受体蛋白的表达没有变化(P >0.05);电针预处理后120min,CB1受体蛋白的表达显著增高(P<0.01)。1.3大麻素CB2受体mRNA和蛋白表达的变化各组、各个时间点RT-PCR和Western blot检测CB2受体mRNA和蛋白表达,结果均没有差异(P >0.05)。2大麻素CB1受体参与电针预处理诱导的快速相脑保护作用2.1神经功能学评分再灌注72h,EA组的神经功能学评分明显高于MCAO组(P<0.01, EA vs MCAO)。AM251可以逆转电针预处理改善神经功能学评分的作用(P<0.01, AM251+EA vs EA),而AM630没有类似作用( P >0.05, AM630+EA vs EA)。MCAO组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组之间比较,神经功能学评分无统计学意义(P>0.05)。2.2脑梗死容积百分比再灌注72h,EA组的脑梗死容积百分比明显低于MCAO组(P<0.01, EA vs MCAO)。AM251可以逆转电针预处理降低脑梗死容积百分比的作用(P<0.01, AM251+EA vs EA),而AM630没有类似作用( P >0.05, AM630+EA vs EA)。MCAO组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组之间比较,脑梗死容积百分比无统计学意义(P>0.05)。第二部分大麻素受体在电针预处理诱导的延迟相脑保护中的作用方法1观察电针预处理后大鼠脑内大麻素受体表达的变化成年雄性SD大鼠(280-320g)66只,按随机数字表法分为3组:CON组、SP组和EA组。CON组:无任何处理;SP组:戊巴比妥钠(40mg/kg,i.p.)麻醉;EA组:腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后电针刺激“百会穴”,选用疏密波、频率2/15 Hz、电流强度1 mA,持续刺激30min,处理1次。分别在电针预处理后的2h、6h、12h、18h和24h,取大鼠右侧半脑纹状体行RT-PCR和Western blot检测大麻素CB1和CB2受体含量。2研究大麻素受体在电针预处理诱导的延迟相脑保护中的作用成年雄性SD大鼠(280-320g)56只,按随机数字表法分为7组(n=8):Sham组、MCAO组、EA组、Vehicle+EA组、AM630+EA组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组。Sham组仅行假手术;MCAO组为大脑中动脉阻塞再灌注;EA组在MCAO前24 h给予电针刺激“百会穴”30min;Vehicle+EA组、AM251+EA组和AM630+AM251+EA组在电针预处理前30min分别给予溶剂3ml/kg(ip)和AM251 1mg/kg(ip);AM630+EA组和AM630+AM251+EA组在电针预处理前3h给予AM630 1mg/kg(ip)。除Sham组外其余各组均在电针预处理后24h行MCAO,缺血120min再灌注72 h行神经功能学评分和TTC染色,检测脑梗死容积百分比的变化。结果1电针预处理后大鼠脑内大麻素CB1和CB2受体表达的变化1.1大麻素CB1受体mRNA和蛋白的表达各组、各个时间点RT-PCR检测结果没有差异(P >0.05);与CON组和SP组相比,电针预处理后2h,CB1受体蛋白的表达量显著增高(P<0.01),在其它时间点其表达量没有变化(P >0.05)。1.2大麻素CB2受体mRNA的表达与CON组和SP组相比,电针预处理后18h,CB2受体mRNA的表达显著增高(P<0.01);电针预处理后24h其含量降至CON组水平。1.3大麻素CB2受体蛋白的表达Western blot结果显示,与CON组和SP组相比,电针预处理后24h,CB2受体蛋白的表达量显著增高(P<0.01),在其它时间点其表达量没有变化(P >0.05)。2大麻素CB2受体参与电针预处理诱导的延迟相脑保护作用2.1神经功能学评分再灌注72h,EA组的神经功能学评分明显高于MCAO组(P<0.01)。AM630可以部分逆转电针预处理改善神经功能学评分的作用(P<0.01),而AM251没有类似作用(P>0.05)。AM630+EA组和AM630+AM251+EA组之间比较,神经功能学评分无统计学意义(P>0.05)。2.2脑梗死容积百分比再灌注72h,EA组的脑梗死容积百分比明显低于MCAO组(P<0.01)。AM630可以部分逆转电针预处理降低脑梗死容积百分比的作用(P<0.01),而AM251没有类似作用(P>0.05)。AM630+EA组和AM630+AM251+EA组之间比较,脑梗死容积百分比无统计学意义(P>0.05)。小结1.电针预处理可以快速上调大鼠脑内大麻素CB1受体的表达量,而在同样时间点CB2受体表达没有变化;并且CB1受体拮抗剂AM251可以逆转电针预处理诱导的快速相脑保护作用,而CB2受体拮抗剂AM630没有类似作用,提示CB1受体参与了电针预处理诱导的快速相脑保护作用。2.电针预处理可以延迟上调大鼠脑内大麻素CB2受体的表达量,而在同样时间点CB1受体表达没有变化;并且CB2受体拮抗剂AM630可以部分逆转电针预处理诱导的延迟相脑保护作用,而CB1受体拮抗剂AM251没有类似作用,提示CB2受体参与了电针预处理诱导的延迟相脑保护作用。