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骨髓增生异常综合症(Myeloidysplastic Syndrome,MDS)是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患。在我国,MDS发病率有很明显上升趋势,发病率已达到十万分之三,且患者发病年龄比西方国家年轻十岁左右。治疗MDS的主要手段是输血或造血干细胞移植。越来越多的证据发现接受造血干细胞移植后,病人的肝脏出现典型的铁过载症状进而引起病人肝损伤。此外,铁过载还抑制了病患的造血功能及治疗后恢复。尽管当前临床上利用祛铁胺(Desferrioxamine,DFO)、祛铁酮(Deferiprone,DFP)和地拉罗司(Deferasirox,DFX或ICL670)等祛铁药物能够降低肝实质细胞中的铁水平、保护脏器器官并改善MDS患者的预后,但是对于病患祛铁药物治疗所使用的合适剂量仍充满争议,同时祛铁治疗过程漫长且昂贵。因此,深入研究铁过载损伤的分子机制对病患铁过载的治疗具有重要意义。本课题组以人肝细胞HH4为研究模型,详细研究了体外铁过载培养条件下细胞凋亡发生、基因Hepcidin表达调控的信号通路以及蛋白质组和磷酸化蛋白质组差异表达,主要内容如下:(1)铁过载诱导细胞凋亡发生的机制研究。枸橼酸铁铵(FAC)处理HH4细胞0-72hr后,对胞内铁离子含量、细胞活力、活性氧(ROS)水平、氧化应激蛋白表达变化及细胞凋亡进行考察。结果表明HH4细胞铁过载后,胞内铁离子浓度呈时间依赖性增加,而细胞活力呈现浓度和时间依赖性降低。同时,铁过载处理显著增加胞内ROS水平,而添加抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以明显降低FAC诱导的胞内ROS生成。此外,铁过载导致蛋白IκB-α、p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平增加,以及促进转录因子NF-κB p65入核。实验同时发现铁过载处理导致凋亡相关基因表达水平增加,且流式检测确认凋亡比率显著增高。而对凋亡相关蛋白Fas和Bid进行siRNA瞬间干扰后,细胞活力得到恢复。此外,添加GSH后,细胞凋亡率明显降低且氧化应激活化信号途径和凋亡信号途径相关蛋白如p-IκB-α、p-p38 MAPK、p-NF-κB、Caspase-8、Cytc和Caspase-3表达水平呈现显著下调。本部分实验结果表明铁过载诱导了ROS介导的HH4细胞死亡受体途径及线粒体途径凋亡发生。(2)NF-κB参与Hepcidin表达调控研究。本部分实验以不同浓度FAC(0.1、1、5和10 mmol/L)处理HH4细胞48 hr,半定量PCR法检测胞内Hepcidin表达水平。同时利用染色质免疫共沉淀(ChIP)、电泳迁移率实验(EMSA)和双荧光素酶报告基因系统实验,并结合胞内NF-κB活性抑制实验,确定NF-κB对人Hepcidin转录活性的影响。结果表明5 mmol/L和10 mmol/L FAC处理HH4细胞后,Hepcidin表达水平显著增强。ChIP和EMSA实验证实NF-κB能够与Hepcidin基因启动子结合。重组荧光素酶报告质粒TOPFlash-pHepcidin相对荧光素酶活性明显高于对照组;与重组质粒TOPFlash-pHepcidin相比,突变重组荧光素酶报告质粒TOPFlash-pHepcidin-mut相对荧光素酶活性显著降低。同时NF-κB抑制剂BAY 11-7082显著降低了Hepcidin基因的表达。本部分实验结果表明转录因子NF-κB参与了FAC过载诱导Hepcidin表达上调。(3)肝细胞在铁过载模型中的蛋白质组学研究。借助蛋白质组学技术,我们发现与对照组相比,铁过载处理导致HH4细胞58种蛋白质表达水平显著上调以及35种蛋白质表达水平显著下调。随后的GO分析表明铁过载诱导的93种差异表达蛋白与内吞作用、二价、三价金属阳离子稳态平衡、创伤反应、炎症反应、细胞因子分泌的正调控反应、生长调控、抗凋亡以及凋亡的线粒体改变等生物学过程紧密相关。此外,蛋白质组学实验结果显示FAC过载处理诱发TLR2蛋白表达水平上调7倍和IL6ST蛋白表达水平上调2.9倍,而随后的蛋白质免疫印迹实验和TLR2基因干扰实验证实铁过载处理激活了HH4细胞TLR2-MyD88-p-NF-κB-IL-6炎症路径。而另一方面,磷酸化蛋白质组学实验表明HH4细胞铁过载处理导致335种磷酸化蛋白出现差异变化,其中高达11%的磷酸化蛋白与细胞周期进程有关。磷酸化蛋白质组学实验结果同时显示HH4细胞铁过载处理后G2/M期转换关键蛋白CDK1在Thr14和Tyr15位点磷酸化修饰水平增高约10.9倍。进一步的流式检测证实铁过载能够引发HH4和小鼠肝细胞NMH细胞G2/M期阻滞,同时RT-PCR和蛋白免疫印迹检测则表明FAC过载可能经由p53-p21-CDK1、p53-14-3-3 sigma-CDK1或14-3-3 gamma路径诱导了HH4细胞G2/M期阻滞发生。上述实验结果表明铁过载处理导致HH4细胞TLR2介导的炎症反应发生及G2/M期阻滞。