论文部分内容阅读
目的卵巢癌（Ovarian cancer）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，但其致死率居各类妇科恶性肿瘤之首。由于其发病隐匿，缺乏早期诊断手段，约70%的卵巢癌患者确诊时已属晚期。研究发现卵巢癌的发生与遗传因素、初潮和绝经年龄、生殖及内分泌等多种因素有关。近年来，一类非蛋白质编码microRNAs（miRNAs）的出现，为卵巢肿瘤的研究提供了新的思路。miRNAs是一类长度为20-22个核苷酸的非编码小分子RNA，在动物体内miRNA主要通过与靶基因3’-UTR区不完全配对，抑制靶基因mRNAs翻译，参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。随着对miRNA研究的不断深入发现miRNA在多种恶性肿瘤中扮演着重要角色，miRNA可作为抑癌基因或癌基因参与肿瘤的发生发展、转移、耐药等进程。miR-125b是miRNA家族中的重要一员，它在多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,特别是在卵巢癌的发生发展过程中。本研究拟通过在卵巢癌SKOV3细胞株中过表达miR-125b，检测miR-125b对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，及其所调控的潜在靶基因进行预测，以期明确miR-125b在卵巢癌发生发展中的作用。方法本研究通过过表达miR-125b慢病毒颗粒感染卵巢癌SKOV3细胞，嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株，建立稳定过表达miR-125b的SKOV3细胞系。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-125b在SKVO3细胞中的表达；MTT实验观察miR-125b过表达后SKOV3细胞增殖能力的的改变；划痕实验和Transwell侵袭实验分别观察miR-125b过表达后SKOV3细胞迁移和侵袭能力的改变。采用iTRAQ多重化学标记串联质谱（iTRAQ-LC/MS/MS）实验定性及定量分析miR-125b过表达前后SKOV3细胞内蛋白质的变化，筛选出miR-125b可能调控的潜在靶基因。再进一步通过Western blot来验证筛选出的靶基因是否受miR-125b的影响。结果1. MTT实验显示，miR-125b过表达后SKOV3细胞的增殖能力减弱；划痕实验和Transwell侵袭实验显示，miR-125b过表达后SKOV3细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。2. iTQAR多重化学标记串联质谱(iTQAR-LC/MS/MS)实验，结合miRNA候选靶基因预测软件（TargetScan、Pictar等）分析筛选出61种可能受到miR-125b调控的差异表达蛋白质，其中16种蛋白质在表达水平上存在显著差异。通过生物信息学对差异表达的蛋白质进行功能分析（整合NCBI、KEGG PATHWAY、Swiss-Prot等多个数据库信息），我们选择ERBB2基因作为miR-125b的一个潜在靶基因进行进一步研究。3. Western blot结果显示，miR-125b能抑制ERBB2基因的表达。结论本研究证明miR-125b能够抑制SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭，并可能通过降低潜在靶基因ERBB2的表达而实现。