健脾、疏肝方药对Th细胞分化及其信号蛋白钙调神经磷酸酶转录表达的影响 目的：CD4~+T细胞经抗原刺激活化后发生功能性极化，不断获得的证据表明，此分化过程是免疫应答调节的关键环节。如分化为Th1，则分泌IFN-γ等因子，介导细胞免疫；分化为Th2则分泌IL-4等淋巴因子，介导体液免疫。CD4~+T细胞活化、分化和增殖涉及PKC、MAPK、CaN等多条信号通路，以及一系列信号转导蛋白、转录因子的活化和相互作用，启动相关细胞因子及其受体的转录表达，诱导CD4~+T细胞分化为成熟的效应细胞Th1和Th2，发挥免疫调节的作用；但是如Th1/Th2分化不平衡，则可产生多发性硬化、关节炎等多种自身免疫性疾病。我们以往研究发现，四君子汤可使低水平T淋巴细胞活性和IL-2、IgM升高，柴胡疏肝散则使高水平T、B淋巴细胞转化率和IL-2、IL-6降低，表明两方对免疫失常均有明显的改善作用。本实验从方药角度，健脾方药选择四君子汤和疏肝方药选择柴胡疏肝散，制备成中药血清，干预体外定向诱导分化的Th细胞，观察IFN-γ、IL-4、CaN mRNA表达的变化，以探寻补气方药与理气方药对Th细胞分化的影响，明确两种治疗方法对免疫调节的药理机制，为临床中医治疗免疫性疾病的用药选择提供实验依据。 中南大学 博士学位论文方法： 1、取正常Wistar大鼠，分别灌服中药四君子汤和柴胡疏肝散，取血分离血清，过滤除菌，灭活备用。正常血清组只灌服生理盐水。 2、取正常Wistar大鼠脾脏，制折成细胞悬液，尼龙毛过柱，分离T细胞和B细胞，以丝裂霉素C活化B细胞作为抗原递呈细胞，并力 ConA刺激T细胞活 化，加 ova作为仇原，15％中药血清 RPMI 1640培养24小时和 48小日。 3、分组： 生理盐水M）组0生理盐水以）VI）， 0．1％ova ＊）无血清对照组（力 0．l％ova溶液 20 ul）， 10％ova ＊）无血清对照组（力 10％ova溶液20ill）， 0．1％ova（D）四君子汤血清组（力 0．lyova溶液 20 111）， 10％ova（E）四君子汤血清组（力 10％ova溶液 20 ill）， 10％Ova ＊）柴胡疏肝散血清组 力0．风Ova溶液20 p·l）， 0．l％ ova 门）柴胡疏肝散血清组（加 10％ova 溶液 20 111）， 生理盐水m）正常血清组o生理盐水20 pl）， 0．1％ova ＊）正常血清对照组（力 0．1％ova溶液 20 111）， 10％ova ＊）正常血清对照组（力 10％ova溶液 20 ul）。 4、分别提取总 RNA禾胞浆蛋白，RT－PCR检测 IFN－Y、IL－4、C呐mRNA，以Western blotting检狈CaN的表达。 v 中南大学 博士学位论文结果： l、与未加抗原的生理盐水组十卜，其他各组IFN－Y、IL－4mRNA的表达均明显增加，P ①．0＊ 上。j。，1＊－Ym＊A在10洲v。对照组表达量最大，几A帆NA在0．卜们M对照组表达增高最明显。 2、经ConA刺激活化培养t18刁时后，各组T细胞几－4 mRNA表达量均明显高于生理盐水对照组P①．01；O．1洲M对照组的表达明显高于10％对照组，P①．OO上 四君于汤和柴胡疏肝散中药血清两组IL－4 mRNA的表达明显低 于0．I％ova对照组，P＜0．05，但四君子汤和柴胡疏肝散中药血清两组之问的比较无显著意义。10洲M各组之间未见显著变化。 3、经C。nA刺激活化培养18 小时后，各组T细胞IFN－YmRNA的表达均明显高于生理盐水组，I’①．05；10M 对照组表达高于0．l％ova对照组，P（．001 10％ova四君子汤中药血清组表达比 10％ova对照组明显降低，P（0．01；10洲 柴胡疏肝散中药血清组与 10贴对照组比较无统计意义，但明显高于10洲 四君子汤中药血清组，P （0．05。0．1％ova四君子汤组表达高于0．1％ova对照组和0．l％ova柴胡疏肝散组，P①．05。 4、CaN转录、表达在0．1赃 对照组比其他组增强，与10晌对照组相比差异有显著性，P①．01。在0．1肌 组，加入柴胡疏肝散和四君子汤血清后，CaN表达均有明显降低，但两者之间降低程度无显著差别；柴胡疏肝散增高 10洲 中的 CaN表达，与对照组比较，差别有显著性，P＝0．05。 VI 中南大学 博士学位论文 结论： l、四君子汤是通过“补虚”而增强免疫功能，可以调节Th细胞Thl八 双向分化，并偏于对仆 作用，适用于致病性讣 介导的炎症性肠病等免疫性疾病的治疗。 2、柴胡疏肝散的功效是理气疏肝、调畅气机，主要以“调实”为主，对于仆 介导的免疫性疾病如支气管哮喘等的治疗有实用价值。 3、柴胡疏肝散可能是通过调节CAN转录表达影响Th的分化。 4x 综上所述，本文研究结果对于虚证与实证在免疫学的用药选择方面有参考价值。