研究背景及目的：食管癌(esophageal cancer, EC)是最常见消化道恶性肿瘤之一,发病率及死亡率分别位居所有恶性肿瘤中的第八位和第六位,主要病理类型分有鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma ESCC)和腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)两大类,其中绝大部分为ESCC;我国是EC发病率和死亡率最高的国家之一,其发病率位居恶性肿瘤的第4位。由于EC明确诊断时很多病例都处于局部晚期或淋巴结转移,同时治疗上缺乏靶向性,因此,目前EC预后效果仍旧不佳,术后总的5年生存率仅10-20%。更好的阐明EC的生物学行为,了解其发病机制对发展高效、特异性强的诊断方法和治疗策略及提高EC术后生存具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一种长约21-25核苷酸的非编码单链内源性RNA分子,进化上高度保守,主要通过转录后及翻译水平负性调控基因表达,在机体生长发育、细胞分化增殖、细胞凋亡、激素分泌和肿瘤形成等多个环节中起着重要的作用。近来,越来越多研究证明,miRNA的生成及功能异常与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在肿瘤发生过程中类似癌基因或抑癌基因。研究证据提示miRNA参与了食管癌的发生、发展等病理过程,但具体作用机制仍旧未完全阐述清楚。因此,进一步研究食管癌中miRNA表达谱及对异常表达miRNAs进行功能分析有助于揭示食管癌发病新机制,同时为食管癌早期诊断、预后判断及新的治疗策略提供思路。本课题从研究食管鳞癌miRNAs表达谱着手,分析异常表达的miRNA在食管鳞癌中可能的作用机制。研究首先拟采用生物基因芯片分析并比较食管鳞状细胞癌与正常食管鳞状上皮粘膜miRNAs表达谱差异,筛选并验证食管鳞状细胞癌中相关特异的、异常表达的miRNAs,并确定其靶基因；进而,研究食管鳞癌异常表达的miRNAs及其靶基因在食管鳞癌发生、发展中的作用机制、以及可能的治疗潜力。本课题研究提示了异常表达的miRNAs在食管鳞状细胞癌发生、发展中扮演了重要角色,也为食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断及靶向治疗提供理论据。第一部分食管鳞状细胞癌中特异miRNAs鉴定目的：分析比较食管鳞状细胞癌中miRNAs表达谱,筛选并验证食管鳞癌相关、特异性的miRNAs。方法：利用TaqMan MicroRNA Array生物芯片检测并比较13对食管鳞癌及癌旁正常粘膜组织标本的miRNAs表达谱,筛选出ESCC中异常表达的miRNAs;通过分析比较并结合文献报道,从31个候选]miRNAs中选定了10个进行初步分析,运用实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法在20配对ESCC及癌旁组织标本中初步验证了miR-21, miR-135b, miR-133b等3个表达异常的miRNAs：在50对ESCC及癌旁组织标本中进一步验证上述3个异常癌表达miRNAs的表达水平,确认与ESCC组织相关特异的miRNAs。结果：1,通过生物芯片,发现食管鳞癌组织中31个miRNAs表达异常。2,利用qRT-PCR技术,在配对大样本食管鳞癌和癌旁正常粘膜组织筛选并验证,确定miR-21, miR-135b, miR-133b是ESCC相关的miRNAs。结论：miR-21,miR-135b, miR-133b是ESCC相关、特异的miRNAs。第二部分miRNA-133b靶基因的预测及验证目的：预测并确认miR-133b下游靶基因。方法：运用生物信息学方法并结合文献分析,从MiRbase、Targetscans及PicTar等靶基因预测数据信息库中预测,筛选出与肿瘤密切相关的基因作为miR-133b在ESCC中候选靶基因；然后,在40对配对ESCC及癌旁正常粘膜组织中,运用qRT-PCR、蛋白印记法(Western Blot)及免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)等方法检测候选基因的表达水平,运用qRT-PCR检测miR-133b表达水平,并比较miR-133b与候选基因表达水平的相关性,确定miR-133b下游靶基因。结果：1,通过miRNAs数据库预测并结合文献分析,预测LASP1、CDKN2AIP及BCL2L2可能是miR-133b的靶基因；2,运用qRT-PCR、Western Blot方法分析3个候选靶基因与miR-133b的关系,在ESCC组织中,我们发现miR-133b表达水平下调,而LASP1在mRNA及蛋白水平表达均上调,两者表达水平呈明显的负相关(相关系数=-0.499,p=0.011)；而其他两个基因与miR-133b表达水平无相关性；免疫组化揭示LASP1在食管鳞癌组织的细胞质及细胞核中均有表达。结论：LASP1为miR-133b的下游靶基因。第三部分miRNA-133b及LASP1在食管鳞状细胞癌发病中作用机制探讨目的：揭示miR-133b及LASP1在食管鳞状细胞癌发生、发展中可能作用机制。方法：体外培养食管鳞状细胞癌细胞株ECA19、KYSE510,运用基因获得和／或缺失功能研究(gain/loss-of-function)技术,瞬时传染miR-133b-mimic及siRNA-LASP1后,运用qRT-PCR方法检测miR-133b表达水平变化,运用qRT-PCR、Western Blot等方法LASP1的表达水平变化；同时运用MTT assay方法检测细胞增殖；Annexin V-FITC assay;方法检查对细胞凋亡的影响；Millcell实验检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果：1,在ECA10、KYSE510细胞中,miR-133b-mimic转染72小时后miR-133b表达水平明显上调(p=0.000,p=0.024)；而LASP1的mRNA表达水平明显下调(p=0.017,p=0.006)。2,在ECA10、KYSE510细胞中,siR-LASP1转染72小时后miR-133b表达水平无明显变化,而LASP1的mRNA (p=0.006, p=0.039)及蛋白表达水平均明显下调(p=0.003,p=0.001)。3, MTT assay方法检测细胞增殖,转染miR-133b-mimic或siR-LASP1后72小时,ECA109、KYSE510细胞株增殖能力下降最明显；联合miR-133b-mimic和siR-LASP1转染后ECA109、KYSE510细胞株增殖能力较单一转染miR-133b-mimic或siR-LASP1下降更明显(p=0.000, p=0.002;p=0.007, p=0.027).4, Millcell侵袭实验中,ECA109及KYSE510细胞株转染miR-133b-mimic或siR-LASP1后18小时,侵袭能力较对照组明显下降(p=0.001,p=0.000; p=0.001,p=0.000)。5, Millcell迁移实验中,ECA109及KYSE510细胞株转染miR-133b-mimic或siR-LASP1后8小时,其迁移能力较对照组下降明显,(p=0.01,p=0.005;p=0.02,p=0.005)结论：转染miR-133b-mimic和siR-LASP1能有效上调miR-133b表达水平和下调LASP1表达水平；miR-133b及LASP1在食管鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移等生物学行为中具有重要作用。