下肢深静脉血栓形成(Deep vein thrombosis,DVT)是临床上常见的外周血管性疾病,每年的发生率在0.1%至0.27%之间。下肢DVT的治疗主要包括(1)早期预防症状性肺动脉栓塞、阻止血栓的蔓延和减轻下肢水肿及疼痛等症状;(2)及时清除血栓,包括药物溶栓、手术切开取栓术;(3)长期抗凝预防深静脉血栓复发以及减少血栓后综合征(Post-thrombosis syndrome,PTS)的发生。PTS是DVT的长期并发症,即使DVT患者接受规范化抗凝治疗,2年后PTS的发生率仍高达20%~50%,5年后有约15%的患肢出现溃疡,静脉性跛行的发生率高达40%,约15%的病人出现行走困难,100%的病人生活质量受到了影响。目前临床上针对PTS的治疗手段有限且治疗效果较差,因此,深入研究DVT发生发展过程中的分子机制,寻找早期诊断、安全高效的生物治疗手段及效果确切的预后评价新方法,将为患者带来福音,也是国家科技攻关的需要。干细胞治疗作为新兴的科学技术,是一种富有前景的治疗策略,为各种难治性疾病的治愈带来了新的希望。目前在心血管疾病中已取得了一些可喜的临床前及临床研究成果,将干细胞应用于DVT的治疗及PTS的预防将是一个新的治疗方向,深入研究提高干细胞治疗效果具有重大的临床意义。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是主要存在于人骨髓中的多能干细胞,研究发现DVT后24h循环中的EPCs明显增加,于48h后达到高峰,动员的EPCs从骨髓中被释放到微静脉内,进而归巢到血栓部位,在血栓的再通过程中起着重要作用,尤其是在血栓中的血管新生和对内皮修复两个方面。但EPCs从骨髓中动员归巢到缺血部位的数量有限,且循环中的EPCs易受到多种因素(如年龄、吸烟和糖尿病等)的影响,使EPCs的数量及功能受到影响。因此,如何提高EPCs的归巢和成血管能力显得尤为重要。本实验首先通过密度梯度离心法分离出人外周血来源的单个核细胞,应用EGM-2 MV培养基体外培养,培养出细胞通过细胞形态、表面标志物检测及双荧光染色等方法进行鉴定。通过前期的lnc RNA基因芯片检测结果中找到一个差异表达的lnc RNA WTAPP1,应用慢病毒技术上调和下周此lnc RNA的表达,CCK8法检测lnc RNA WTAPP1对EPCs增殖能力的影响、划痕实验及侵袭实验检测lnc RNA WTAPP1对EPCs迁移能力的影响、成血管实验检测lnc RNA WTAPP1对EPCs血管新生作用的影响。再通过生物信息学分析找到lnc RNA WTAPP1的靶向调控分子金属蛋白酶1(metal matrix proteinase 1,MMP1),MMP1在细胞的迁移及血管新生过程中起着重要作用。通过mi RNA基因芯片技术筛选出差异表达且促进EPCs功能的mi RNA,同时验证这个mi RNA与MMP1的调控关系,同时我们还进一步验证此lnc RNA与自噬、Akt/PI3K/m TOR信号通路之间的联系。上述研究结果为下一步的提高EPCs功能的研究奠定了理论基础,并可能为EPCs移植治疗DVT及缺血性疾病的临床研究提供重要的实验依据,为DVT的临床治疗提供新的思路和方法。本实验研究分为三部分,下面就研究目的、方法、结果、结论作如下分述。第一部分人外周血来源内皮祖细胞的分离、培养和鉴定目的:采用密度梯度离心法分离、培养和鉴定人外周血来源的内皮祖细胞,为进一步的实验研究提供符合条件的工具细胞。方法:收集健康成人外周血60ml,密度梯度离心法分离单个核细胞,接种到Ⅰ型胶原包被的六孔板中,应用含有多种生长因子的EGM-2MV培养基,培养7天后对培养基半换液,细胞融合至90%以上时进行细胞传代。并通过普通光学显微镜下观察细胞形态学特征,流式细胞技术及Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色检测对原代细胞进行鉴定。结果:细胞呈集落样生长,呈多边形、梭形或卵圆形,培养至第2-3代的细胞呈典型的铺路石样生长。细胞形态学上符合典型EPCs的特点。双荧光染色结果显示:细胞具有吞噬Di I-Ac-LDL并能结合FITC-UEA-1的功能。对细胞表面标志分子CD31、CD34、CD45、CD133、CD309进行流式细胞术检测,结果符合EPCs表面标志分子的特征。结论:本实验通过密度梯度离心法分离出人外周血来源的单个核细胞,通过含有多种生长因子的EGM-2 MV培养基进行培养,其形态学上符合EPCs生长特点,能够吞噬Di I-Ac-LDL且能够结合FITC-UEA-1,流式细胞术检测抗原CD31、CD34、CD45、CD133、CD309,结果符合典型EPCs的表面标志物的特点,此类细胞可以满足后续实验的需要。第二部分 长链非编码RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移与成血管功能的调节作用目的:探索lnc RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移及成血管功能的调控作用。方法:1.合成lnc RNA WTAPP1 si RNA及过表达lnc RNA WTAPP1的慢病毒,用慢病毒感染EPCs,荧光显微镜下观察感染效率,q RT-PCR检测lnc RNA WTAPP1调控的效果;2.细胞分组:正常EPCs、空病毒感染EPCs、lnc RNA WTAPP1 si RNA慢病毒感染的EPCs及过表达lnc RNA WTAPP1慢病毒感染的EPCs;3.CCK8法检测四组EPCs的增殖能力变化;4.划痕实验及侵袭实验检测四组EPCs中迁移能力的变化;5.体外Matrigel胶成血管实验及体内基质胶栓实验检测四组EPCs的成血管能力;结果:1.合成的慢病毒感染EPCs后,感染效率大于90%,q RT-PCR检测lnc RNA WTAPP1表达的结果提示慢病毒感染EPCs调控效果稳定可靠;2.CCK8法检测细胞增殖能力结果发现各组细胞的吸光度无明显差异,P>0.05,无统计学意义,提示lnc RNA WTAPP1对EPCs的增殖无明显影响;3.划痕实验结果:lnc RNA WTAPP1 si RNA干扰组较空病毒组划痕区迁移细胞数量明显减少(116.7±19.9 VS 182.0±13.7,P<0.01),二者具有统计学差异;lnc RNA WTAPP1过表达组划痕区迁移细胞数量较空病毒感染组明显增加(249.0±28.0 VS 182.0±13.7,P<0.01),二者同样具有统计学差异。侵袭实验结果:lnc RNA WTAPP1 si RNA干扰组较空病毒组侵袭的细胞数量明显减少(18.7±2.5 VS 33.0±2.0,P<0.001),二者具有统计学差异;lnc RNA WTAPP1过表达组Transwell小室膜下迁移细胞数量较空病毒感染组明显增加(45.7±4.2 VS 33.0±2.0,P<0.01),二者具有统计学差异。4.体外Matrigel胶成血管实验提示lnc RNA WTAPP1 si RNA慢病毒感染的EPCs的成血管能力较空病毒组明显降低(28.5±4.8 VS 43.5±3.7,P<0.001),而lnc RNA WTAPP1过表达组的EPCs成血管能力增加(63.3±5.0 VS 43.5±3.7,P<0.001),差异均具有统计学意义。体内基质胶栓实验提示lnc RNA WTAPP1 si RNA慢病毒感染的EPCs的成血管面积占总面积的比例较空病毒组明显减少(0.30±0.04 VS 0.43±0.09,P<0.05),而lnc RNA WTAPP1过表达组的EPCs成血管能力增加(0.75±0.05 VS 0.43±0.09,P<0.001),差异均具有统计学意义,结论:上调lnc RNA WTAPP1的表达可提高EPCs的迁移及成血管功能,反之,下调lnc RNA WTAPP1的表达可抑制EPCs的这些功能。第三部分 长链非编码RNA WTAPP1调节内皮祖细胞迁移与成血管功能的机制研究目的:探索lnc RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移及成血管功能的调控机制。方法:1.q RT-PCR检测lnc RNA WTAPP1对MMP1表达的影响:细胞分为正常EPCs、空病毒感染EPCs、lnc RNA WTAPP1 si RNA感染EPCs及过表达lnc RNA WTAPP1感染的EPCs四组,q RT-PCR检测各组EPCs中MMP1的表达量;2.Western blot法检测lnc RNA对EPCs中MMP1蛋白表达的影响:细胞分为正常EPCs、空病毒感染EPCs、lnc RNA WTAPP1 si RNA感染EPCs及过表达lnc RNA WTAPP1感染的EPCs四组,Western blot检测各组EPCs中MMP1的蛋白表达量;3.探索mi RNA在lnc RNA WTAPP1调控MMP1中的作用机制:3.1通过mi RNA基因芯片技术检测lnc RNA WTAPP1 si RNA慢病毒稳转的EPCs中差异表达的mi RNA;3.2筛选与MMP1存在潜在靶向调节关系的mi RNA;3.3 q RT PCR验证表达差异的mi RNA;3.4合成mi RNA minics及inhibitor慢病毒,感染EPCs细胞,检测慢病毒感染效率;3.5通过q RT-PCR及Western blot验证mi R-3120-5P对MMP1表达的调节作用;3.6通过侵袭实验及成血管实验验证mi R-3120-5P对EPCs迁移及成血管功能的影响;4.Lnc RNA WTAPP1与mi R-3120-5P表达量之间相关关系的探索:对lnc RNA WTAPP1过表达的EPCs中mi R-3120-5P及lnc RNA WTAPP1的相对表达量进行Pearson相关分析;5.探索lnc RNA WTAPP1、MMP1 m RNA及mi R-3120-5P三者间的关系:通过Blast比对lnc RNA WTAPP1、MMP1 m RNA及mi R-3120-5P三者的核苷酸序列,分析三者存在调控关系的分子基础;6.通过lnc RNA WTAPP1的CNC分析寻找相关的信号通路;7.Akt/PI3K/m TOR信号通路在lnc RNA WTAPP1对MMP1调控机制中的作用:通过Western blot技术对lnc RNA WTAPP1过表达及si RNA慢病毒感染的EPCs(以正常EPCs及NC慢病毒感染的EPCs作对比)中磷酸化的Akt、PI3K及m TOR的表达量变化。8.自噬在lnc RNA WTAPP1对MMP1调控机制中的作用探索:分别加入一种常用自噬促进剂雷帕霉素以及转染自噬关键蛋白Atg5的si RNA来促进和干扰细胞自噬来观察EPCs中MMP1的表达。从而探索自噬在lnc RNA WTAPP1调节MMP1表达中所扮演的作用。结果:1.q RT-PCR检测发现lnc RNA WTAPP1 si RNA组的EPCs表达MMP1减少,P<0.001,差异具有统计学意义;Western blot检测MMP1蛋白合成也同样减少,P<0.05,差异具有统计学意义。Pearson相关分析结果提示现lnc RNA WTAPP1与MMP1m RNA的表达是呈正相关关系,P<0.05,具有统计学意义。2.miRNA基因芯片检测发现了17个差异较大的(P<0.05)的mi RNAs,其中3个表达上调,14个表达下调。Mi R-3120-5p表达升高3.3倍,q RT-PCR检测验证结果与芯片结果一致,对lnc RNA WTAPP1与mi R-3120-5p的相对表达量进行Pearson相关分析发现lnc RNA WTAPP1与mi R-3120-5p存在着负相关关系,P<0.001,具有统计学意义。应用Target Scan 7.0网站对mi R-3120-5p与MMP1进行分析,发现在MMP13’UTR中的存在mi RNA互补片段。3.通过Blast比对分析mi R-3120-5P与lnc RNA WTAPP1、MMP1三者核苷酸序列,发现MMP1及lnc RNA WTAPP1均与mi R-3120-5P存在互补序列。4.Western blot结果提示我们mi R-3120-5P可抑制MMP1蛋白的合成。5.侵袭实验结果:mi R-3120-5P minics慢病毒感染组EPCs较空病毒组侵袭的细胞数量明显减少(24.7±3.5 VS 38.0±6.2,P<0.01),二者具有统计学差异;mi R-3120-5P inhibitor慢病毒感染的EPCs侵袭的细胞数量较空病毒感染的EPCs侵袭的细胞数量明显增加(59.0±4.6 VS 38.0±6.2,P<0.01),二者具有统计学差异;成血管实验结果:mi R-3120-5P minics慢病毒感染的EPCs的成血管能力较空病毒组明显降低(20.7+4.0 VS 30.3+2.5,P<0.05),而mi R-3120-5P inhibitor慢病毒感染的EPCs成血管能力增加(41.3+4.1 VS 30.3+2.5,P<0.01),差异均具有统计学意义6.对lnc RNA WTAPP1进行CNC分析发现与其具有相同表达模式的m RNA大多参与细胞的分化及成血管功能,这些m RNA多与Akt/PI3K信号通路及自噬相关。7.Lnc RNA WTAPP1 si RNA慢病毒感染组EPCs中Akt、PI3K和m TOR蛋白的磷酸化水平降低,反之,lnc RNA WTAPP1过表达的EPCs中Akt、PI3K和m TOR蛋白的磷酸化水平升高。8.过表达lnc RNA WTAPP1的EPCs中LC3B及Atg5表达降低,而P62表达升高,相反,lnc RNA WTAPP1表达低的EPCs中LC3B及Atg5表达升高,但P62表达降低。结论:Lnc RNA WTAPP1促进EPCs的迁移及血管新生的机制包括:lnc RNA WTAPP1通过抑制mi R-3120-5P和自噬来促进MMP1的表达,后者在细胞迁移及血管新生过程中起着重要的作用;Akt/PI3K/m TOR信号通路的活化在其中起着重要作用。