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目的:马拉色菌是寄生于皮肤表面的常见真菌之一,与一些常见的炎症性皮肤病的发病有着密切的关系,如脂溢性皮炎、马拉色菌毛囊炎和特应性皮炎等。真菌细胞外囊泡已在多种真菌中被发现,其可参与细胞营养摄取、免疫调节和细胞-细胞通信等病理生理过程。研究表明合轴马拉色菌可产生细胞外囊泡,其可诱导外周血单核细胞产生IL-4和TNF-?。然而,细胞外囊泡是否存在于其他马拉色菌亚种中,及其对角质形成细胞的作用,目前均未有报道。在前期工作中我们发现培养于富含脂质条件下的糠秕马拉色菌ABC转运通道的表达上调,文献表明该通道的高表达与细胞外囊泡的合成相关。据此,本研究旨在探究糠秕马拉色菌是否可产生细胞外囊泡,其对角质形成细胞的免疫调节作用以及相关的分子机制,为马拉色菌相关皮肤疾病的发病机制和治疗提供重要的科学数据。研究方法:1、本研究首先利用蛋白组学的方法对培养于富含脂质和缺乏脂质条件下的糠秕马拉色菌菌体蛋白的表达进行鉴定,然后利用生物信息分析的方法对差异表达蛋白进行了分析,对差异表达蛋白在GO与KEGG通路中的富集情况做了进一步分析,后用PRM技术对蛋白组学结果进行验证。2、通过FUN1染色法对待提取细胞外囊泡的糠秕马拉色菌的细胞活性进行检测,而后用超速离心法对糠秕马拉色菌细胞外囊泡进行提取,用负染透射电镜和纳米颗粒示踪技术分别对细胞外囊泡的形态和粒径进行分析鉴定,并通过Amplex Red反应对细胞外囊泡脂质浓度进行定量分析。体外实验中,利用激光共聚焦显微镜技术对糠秕马拉色菌细胞外囊泡与HaCaT细胞融合情况进行评估。在体实验中,利用与体外实验相同的技术对涂抹于小鼠背部皮肤的细胞外囊泡透皮吸收能力进行检测,并评估表皮屏障对该过程的影响。3、通过PCR阵列技术对细胞外囊泡作用后的HaCaT细胞的炎症免疫因子的变化进行初筛,分别用RT-qPCR和ELISA方法对IL-1?、(40)L-6和IL-8在转录水平和翻译水平的表达进行验证,分别用RT-qPCR和western blot的方法对NF-?B、c-Fos和c-Jun在转录水平和翻译水平的表达进行验证。然后通过免疫组化的方法对涂抹细胞外囊泡后的表皮IL-6的表达情况进行检测。在分子机制的研究中,通过western blot方法检测细胞外囊泡作用后不同时间点HaCaT细胞NF-?B p65及磷酸化NF-?B p65的表达变化来初步分析NF-?B信号通路在细胞外囊泡作用后的激活情况,并用ELISA方法检测添加NF-?B信号通路抑制剂前后的炎症因子的表达情况来探究该通路在细胞外囊泡诱导HaCaT细胞表达IL-6中发挥的作用。然后利用慢病毒构建TLR4过表达和病毒空载HaCaT细胞系,分别通过RT-qPCR与western blot方法对病毒感染效率进行验证,而后通过RT-qPCR和ELISA方法分别检测细胞外囊泡作用后过表达细胞系和空载细胞系中IL-6的表达情况来探究TLR4在细胞外囊泡诱导HaCaT细胞炎症因子表达中发挥的作用。类似地,通过RT-qPCR和ELISA的方法分别检测加入TLR4封闭抗体前后的IL-6表达情况进一步验证TLR4在其中的作用。结果:1、在培养于富含脂质条件下的糠秕马拉色菌中,过氧化物酶体、萜类物质合成以及谷胱甘肽代谢等与过氧化酶体相关信号通路的表达呈上调趋势,而核糖体、氨基酸合成、糖酵解/糖异生等与蛋白质和糖代谢相关的通路则呈现下调的趋势。有机酸转运通道、离子通道以及ABC转运通道等膜转运通道的表达在脂质丰富的培养条件下具有明显上调趋势。2、糠秕马拉色菌具有产生细胞外囊泡的能力,该囊泡具有双分子层膜结构,其内部电子密度不均匀,囊泡直径分布于40-400 nm,平均直径为112 nm。糠秕马拉色菌细胞外囊泡与HaCaT细胞共孵育后可被后者内化,且随孵育时间延长内化进入HaCaT细胞的细胞外囊泡逐渐增多且有在核周聚集的趋势。涂抹于小鼠背部皮肤的糠秕马拉色菌细胞外囊泡可被表皮所吸收,且表皮屏障功能在吸收过程中起到限速作用。3、糠秕马拉色菌细胞外囊泡可促进HaCaT细胞与小鼠背部表皮角质形成细胞产生IL-6。NF-?B信号通路的激活参与了糠秕马拉色菌细胞外囊泡促进HaCaT细胞产生IL-6这一过程,且该过程并不依赖于TLR4的介导。结论:1、糠秕马拉色菌在富含脂质培养条件下,其过氧化物酶体相关蛋白的表达上调,蛋白与糖类代谢相关蛋白表达下调。跨膜转运相关通路的表达在富含脂质培养条件下具有显著上调,其中菌体ABC转运通道的高表达可能与细胞外囊泡的合成与分泌相关。2、在富含脂质培养条件下,糠秕马拉色菌具有分泌细胞外囊泡的能力,其细胞外囊泡的直径大小分布范围在40-400 nm之间。糠秕马拉色菌细胞外囊泡可被HaCaT细胞内化,且内化程度与时间呈正相关。糠秕马拉色菌细胞外囊泡具有透皮吸收的能力,且表皮屏障对其在表皮的渗透具有限速作用。3、糠秕马拉色菌细胞外囊泡可促进角质形成细胞分泌IL-6。NF-?B信号通路的激活参与了糠秕马拉色菌细胞外囊泡促进HaCaT细胞分泌IL-6这一过程,该作用不受TLR4的介导。