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目的:鼻咽癌是人类常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国南方高发,放射治疗作为首选治疗。调强放射治疗（intensity-modulated radiation therapy IMRT）技术作为先进放疗技术的代表,突破了传统常规放疗的规则大野照射,以不规则的多个子野从多个角度在保护危及器官及正常组织的同时,最大限度的给予肿瘤区域以较高剂量照射;IMRT还可实现同时补量技术,在治疗次数相同的情况下,给不同的靶区不同剂量。以期提高局控率并减少周围正常组织损伤,因而成为临床肿瘤放射治疗走向精确定位、精确计划设计、精确治疗的标志。近年来,IMRT因其技术优势广泛应用于临床肿瘤放射治疗实践中,如头颈部肿瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等。IMRT在物理学上的优势是显而易见的。关于IMRT放疗近期疗效的报道很多,而且大多数结果尚属满意,但至今没有大范围的、有说服力的这种治疗改善了预后的资料。因此推测这一技术在在生物学上可能存在不足之处。因为治疗技术的复杂性,使在常规照射时一次性给予的剂量分成了多次给予,尤其是MLC静态IMRT技术大大延长了照射时间。常规2Gy的照射1～2min即可完成,而IMRT则常常需要20～40min。这样单位时间内肿瘤吸收剂量就大大降低,有人将这种情况称为“相对剂量率降低”。这种照射模式所致“相对剂量率降低是否影响肿瘤细胞的杀灭”已成为临床放射生物学的热点问题。多年来,人们应用细胞培养、免疫组化、分子生物学技术等对肿瘤细胞相关基因蛋白表达情况进行了研究,积累了大量资料。也有作者就离体细胞IMRT照射后,细胞存活曲线的变化进行过研究,从而推断IMRT照射时间延长,可能导致亚致死性损伤修复增加,放射生物效应降低,但其确切影响仍不清楚,未见其他方面深入的报道。放射治疗模式的改变是否会影响肿瘤细胞的生物效应尚未明确,是否要对IMRT照射模式进行剂量补偿亦尚未定论。文献报道,影响细胞放射敏感性的生物因素主要包括DNA损伤的修复、细胞周期、及细胞凋亡。因此本研究旨在通过给予人鼻咽低分化鳞癌细胞株（CNE-2）不同模式照射,探索IMRT治疗模式对CNE-2生物效应的影响。为今后IMRT在临床上的广泛应用,放疗剂量的调整,缩短照射时间,从而提高肿瘤局控率,进一步提高远期生存率,提供实验依据。并依据检测指标的变化,为患者制定个体化的放疗方案,如:确定分割剂量,选择照射时间,提供理论依据。方法:选取CNE-2为实验对象,分为空白对照、常规照射、模拟IMRT（按设计要求对各个照射剂量点进行照射,每个剂量点分5次照射,其间分别间隔8.0-8.5min, 35min完成）3组,分别给予6MV-X 2、4、6、8Gy4个剂量点的照射;1)运用克隆形成实验（courtenay assay）,检测不同照射模式下CNE-2的存活分数; 2)运用四氮唑蓝法（MTT）进一步验证克隆形成实验的结果;3)运用流式细胞仪（FCM）检测不同照射模式下CNE-2的细胞周期分布及凋亡比例;4)应用RT-PCR及Western blotting方法,检测CNE-2在不同照射模式下,与DNA损伤修复相关的Ku、ATM转录水平及蛋白表达;检测与细胞周期调控相关的Cyclin B1、Cyclin D1的转录水平及蛋白表达,检测与细胞凋亡调节相关的Bcl2、Bax的转录水平及蛋白表达。结果:1.克隆形成检测细胞存活分数:1)CNE-2α/β值为13.177Gy,在2、4、6、8Gy剂量点,常规照射组:SF值分别为0.225,3±0.017,7、0.013±0.002,0、0.002,6±0.000,6和0.0,002±0.000,1,模拟IMRT组:SF分别为0.335,3±0.016,7、0.060,7±0.009,3、0.006,9±0.000,9和0.000,6±0.0,003;模拟IMRT组的SF均高于常规照射组。2)根据线性二次方程拟合的CNE-2细胞存活曲线,常规放疗组:α、β、N、D0、Dq值分别为0.674,8、0.051,2、1.890,0、0.885,0、0.563,0,模拟IMRT组:α、β、N、D0、Dq值分别为0.537,7、0.026,8、2.610,0、0.986,0和0.946,0;α常规>αIMRT,β常规>βIMRT,N常规〈NIMRT,D0常规<D0IMRT,Dq常规<DqIMRT。2.MTT检测细胞增殖比例:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点,常规照射组:细胞增殖比例分别为0.598,7±0.021,7、0.455,7±0.053,7、0.235,3±0.045,3、0.056,7±0.018,3;模拟IMRT组:细胞增殖比例分别为0.682±0.055,0、0.528,3±0.074,3、0.322,3±0.002,0、0.091,7±0.022,3;模拟IMRT组的增殖比例均高于常规照射组。3.流式细胞术检测细胞周期分布（%）:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点1)常规照射组:G2期细胞比例分别为26.77±0.43、38.33±1.77、46.57±1.43、66.97±1.47;模拟IMRT组:G2期细胞比例分别为21.07±0.87、30.83±1.67、39.47±3.03、56.87±2.50;在8Gy剂量点时,2组的CNE-2 G2期细胞比例均高达50%以上（66.97±1.47%与56.87±2.50%）。G2期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐增加;在相同剂量点,模拟IMRT组G 2期细胞比例低于常规照射组。2)常规照射组:S期细胞比例37.50±0.20、26.47±0.97、19.23±0.97、13.67±0.73;模拟IMRT组:S期细胞比例分别为39.73±0.47、32.43±1.03、26.07±2.77、16.87±2.33。S期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐减少;在相同剂量点,模拟IMRT组的S期细胞比例高于常规照射组。3)常规照射组:G1期细胞比例分别为35.73±0.23、35.20±0.80、34.20±0.50、19.37±0.73;模拟IMRT组:G1期细胞比例分别为39.20±0.40、36.73±0.63、34.47±0.33、26.27±0.27。G1期细胞比例随照射剂量的增加无明显变化;在相同剂量点,模拟IMRT组的G1期细胞比例略高于常规照射组。4.流式细胞术检测细胞凋亡比例及存活比例（%）:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点1)常规照射组:早期凋亡比例分别为13.67±1.63、21.07±1.73、28.87±3.33、16.47±1.83;模拟IMRT组:早期凋亡比例分别为10.60±1.20、15.77±0.43、21.30±2.10、29.97±4.47;2Gy、4Gy、6Gy三个照射剂量点,早期凋亡比例随照射剂量的增加而逐渐增加;照射剂量为8Gy时,随剂量的增加,常规照射组早期凋亡比例不再增加反而下降;在相同剂量点,模拟IMRT组的早期凋亡比例低于常规照射组（8Gy除外）。2)常规照射组:晚期凋亡比例分别为3.33±0.67、10.57±1.73、25.10±3.40、70.20±2.90;模拟IMRT组:晚期凋亡比例分别为1.80±0.90、7.13±1.37、21.77±2.47、59.37±3.67。晚期凋亡比例随照射剂量的增加成倍增加;在相同剂量点,模拟IMRT组的晚期凋亡比例低于常规照射组。3)常规照射组:存活比例分别为82.83±1.67、47.40±4.90、21.73±6.93、5.13±1.37;模拟IMRT组:存活比例分别为87.40±2.10、54.70±3.50、27.80±5.30、7.57±1.77。细胞存活比例随照射剂量的增加而降低;在相同剂量点,模拟IMRT组的存活比例高于常规照射组。5.RT-PCR、Western blotting方法检测CNE-2 Ku80、ATM的转录水平及蛋白表达:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点1)常规照射组:Ku80的转录水平分别为0.588±0.131、0.929±0.125、0.840±0.084、0.775±0.084;模拟IMRT组:Ku80的转录水平分别为0.730±0.097、1.074±0.104、0.961±0.076、0.911±0.071;各组不同剂量点之间Ku80的转录水平差异均有统计学意义（P均=0.000）;在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,4个剂量点Ku80的转录水平差异均有统计学意义（P均<0.05）;接受照射后CNE-2 Ku80转录水平升高,模拟IMRT组Ku80的转录水平更高（P均=0.000）,在4Gy剂量点时2组细胞Ku80的转录水平到达峰值,随后表达均下降。2)常规照射组:ATM转录水平分别为0.908±0.110、1.057±0.313、0.923±0.133、0.823±0.075;模拟IMRT组:ATM的转录水平分别为0.732±0.189、0.903±0.181、0.871±0.067、0.775±0.130;接受照射后,与空白对照比较,2组CNE-2 ATM转录水平均上调（P均<0.005）;各组不同剂量点之间,ATM的转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）;在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,ATM的转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）。Western blotting方法检测CNE-2 Ku80、ATM的蛋白表达均得到相似结果。6.PT-PCR、Western blotting方法检测CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的转录水平及蛋白表达:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点1)常规照射组:Cyclin B1的转录水平分别为0.745±0.068、0.624±0.100、0.518±0.054、0.428±0.038;模拟IMRT组:Cyclin B1的转录水平分别为0.881±0.075、0.711±0.054、0.617±0.061、0.528±0.046;2组Cyclin B1的转录水平随照射剂量的增加而降低;各组不同剂量点之间,Cyclin B1的转录水平差异均有统计学意义（P均=0.000）;且在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,Cyclin B1的转录水平差异均有统计学意义（P均<0.05）,模拟IMRT组Cyclin B1的转录水平高于常规照射组。2)常规照射组:Cyclin D1的转录水平分别为0.857±0.090、0.810±0.327、0.798±0.303、0.802±0.038;模拟IMRT组:Cyclin D1的转录水平分别为0.822±0.063、0.701±0.213、0.812±0.093、0.801±0.064,各组不同剂量点之间转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）;在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,Cyclin D1的转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）。Western blotting方法检测CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表达均得到相似结果。7.PT-PCR、Western blotting方法检测CNE-2 Bcl2、Bax的转录水平及蛋白表达:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点1)常规照射组: Bcl2的转录水平分别为0.298±0.029、0.308±0.024、0.290±0.033、0.273±0.025;模拟IMRT组:Bcl2的转录水平分别为0.313±0.030、0.297±0.028、0.294±0.021、0.293±0.025;各组不同剂量点之间,转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）;在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,Bcl2的转录水平差异均无统计学意义（P均>0.05）。2)常规照射组:Bax的转录水平分别为0.618±0.061、0.706±0.032、0.817±0.064、0.915±0.076;模拟IMRT组:Bax的转录水平分别为0.513±0.051、0.606±0.087、0.662±0.132、0.721±0.086;2组Bax的转录水平随照射剂量的增加而升高;各组不同剂量点之间,Bax的转录水平差异均有统计学意义（P均=0.000）;在相同剂量点,常规照射组与模拟IMRT组LSD法两两比较,Bax的转录水平差异均有统计学意义（P均<0.05）,模拟IMRT组Bax的转录水平低于常规照射组。Western blotting方法检测CNE-2 Bcl2、Bax的蛋白表达均得到相似结果。结论:1.照射时间延长,CNE-2存活分数增加,提示对肿瘤细胞的杀灭减少,在此期间可能发生亚致死性损伤修复,放射敏感性下降,放射生物效应降低。2.电离辐射诱导CNE-2 G2期阻滞,其阻滞作用随剂量增加而增加;模拟IMRT照射时间的延长,对G2期细胞阻滞作用减弱。电离辐射诱导CNE-2凋亡,细胞凋亡比例随照射剂量的增加而增加,细胞存活比例随照射剂量的增加而降低。模拟IMRT照射时间延长,CNE-2凋亡比例下降及存活比例均上升,导致辐射生物效应降低。流式细胞术较好地反映了辐射对CNE-2细胞周期分布及凋亡比例的影响。3.应用RT-PCR、Western blotting方法检测ATM、Ku80、Cyclin D1、Cyclin B1、Bcl2及Bax的转录水平及蛋白表达,并计算Bcl2/Bax的比值,可能有助于评价CNE-2放射生物效应的改变。IMRT时间延长,可能有利于SLDR,降低放射敏感性。DNA损伤修复相关因子Ku80、ATM,细胞周期素相关因子Cyclin D1、Cyclin B1,凋亡相关因子Bcl2、Bax的表达,可能部分预测辐射生物效应的变化。与常规放疗相比,IMRT这种高剂量率、多间歇、照射时间延长的照射模式有其独特的辐射生物效应,需要更进一步的研究。