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研究背景:不孕不育症正日益成为一个令人广泛担忧的社会问题。研究显示,约有50%的不孕不育病例由男方因素导致。其中,15%-20%的男性不育病例具有潜在的遗传学原因。尽管近年来在男性不育致病基因的鉴定方面取得了相当大的进步,但其遗传学原因仍未明确。弱精子症（asthenozoospermia,AZS）是一种男性最常见的不育症类型,导致了高达80%的男性不育病例。这其中,精子缺陷导致的孤立型AZS尤为常见。弱精子症常合并有少精或畸形精子症,大约占不育症的19%,其中精子鞭毛多种形态异常（multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF）是一种特殊的弱畸精子症,其特征是精子鞭毛异质性的组合和精子活力严重受损。目前,对AZS致病的认识仍然非常有限,其导致精子活力降低和或畸形的机制也有待于进一步研究。因此,研究弱精子症导致男性不育的遗传学机制有助于明确男性不育的致病机制,并为临床诊治提供对策。目的:本研究通过全外显子测序（whole exon sequencing,WES）技术,在安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心建立的弱畸精子症（鞭毛畸形）专病队列及与其他合作团队建立的MMAF队列中的原发男性不育患者中,筛选出导致弱精子症的可能致病基因,通过构建基因敲除小鼠模型,以鉴定弱精子症新的致病基因并探索其致病机制。在此基础上,为患者提供卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）助孕治疗,并监测患者的ICSI临床结局,为弱精子症的基因诊断、遗传学咨询和临床治疗方案的选择提供理论支持和指导。方法:通过对本中心弱畸精子症专病队列和合作团队MMAF队列的患者血样行WES检测,在本中心发现2例严重弱畸精子症患者（NK038、NK062）携带同一种候选致病基因,另1例来自中东（伊朗）的MMAF患者（P1）携带另一种候选致病基因。本中心的2例患者分别来自2个没有血缘关系的家庭,其父母均非近亲婚配,2例患者的亲代血样均采集;来自中东（伊朗）的MMAF患者（P1）,其父母是近亲婚配（表亲）,其亲代血样未能采集。我们通过Sanger验证和采用一系列的分子实验手段及超微结构观察（蛋白印迹（WB）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、免疫荧光（IF）及电子显微镜（SEM＆TEM）等）,在转录和翻译水平验证基因突变对精子鞭毛结构和功能的影响,并随访了3例患者的ICSI结局。同时,针对其中的1个候选致病基因构建基因敲除小鼠模型,观察该小鼠精子各项参数和功能的变化及其早期胚胎发育情况。结果:对本中心的2例患者行WES发现其分别携带SLC26A8基因的两种新的潜在错义突变（NK038 III‐1:c.212G>T,p.Arg71Leu;c.290T>C,p.Leu97Pro/NK 062III‐1:c.290T>C,p.Leu97Pro）和一个功能缺失突变（NK 062 III‐1:c.1664del T,p.Ile555Thrfs*11）。Sanger测序验证了2例患者的SLC26A8基因突变,且进一步通过检测亲属外周血的DNA,发现2名患者的父母均为SLC26A8基因的杂合突变携带者。此外,NK062患者的舅舅也被验证为杂合突变携带者,其可正常生育。以上所发现的变异与不育表型均符合隐性遗传模式的家系共分离。2例患者的精子前向运动率均小于1%,且光镜和扫描电子显微镜（SEM）均显示大量精子中段（精子线粒体位置）明显变细,占比大于70%。透射电子显微镜（TEM）观察发现:与正常精子相比,SLC26A8突变患者的精子鞭毛表现出多种缺陷,包括线粒体鞘和环的缺失。为了验证SLC26A8基因双等位突变对蛋白表达的影响。患者IF结果显示:在对照组的精子中,SLC26A8的IF信号定位于精子鞭毛中段与主段交界处的中环,而SLC26A8基因突变患者精子中,荧光信号缺失。且精子蛋白的Western blot结果显示,患者精子中的SLC26A8蛋白表达完全缺失。此外,与对照组精子相比,患者的精子环结构蛋白SEPT4的定位完全缺失,线粒体蛋白HSP60的定位也显著降低。同时,通过构建SLC26A8蛋白的三维结构模型,发现SLC26A8突变体α螺旋区的三维结构缺陷,导致了其稳定性降低。对2例患者的ICSI结局随访发现,其均获得妊娠并正常分娩。对来自中东（伊朗）患者行WES检测发现其携带CFAP206基因双等位截短变异（c.1430dup A;p.Asn477Lysfs Ter15）。RT-PCR显示,该基因为睾丸高表达基因,且在人类气道纤毛中表达水平较低。该患者的精液参数表现为严重的弱畸精子症,大多数精子表现为短尾、无尾、卷尾和不规则尾。为了研究CFAP206截短变异对人类精子鞭毛的超微结构的影响,我们通过IF实验发现:相较于对照组,患者精子的RSPH1定位显著缺失,而WDR66的定位完全缺失。患者行ICSI助孕,但未能妊娠。为了进一步证实CFAP206基因突变与弱畸精子症（MMAF）的相关性,我们构建了Cfap206基因敲除小鼠模型（Cfap206-/-）。Cfap206基因的敲除未对小鼠的生长发育及基础生命活动产生影响。纯合突变小鼠睾丸组织的WB显示,Cfap206-/-小鼠睾丸中的CFAP206蛋白完全缺失。对Cfap206-/-小鼠进行配繁实验,发现雄鼠均不能繁衍子代。与对照组相比,Cfap206-/-小鼠睾丸/体重比和睾丸的HE染色未见明显差异。精子计数与动力参数分析显示:Cfap206-/-小鼠的精子数量、活率及前向运动率显著降低;形态学检查及SEM观察发现,Cfap206-/-小鼠精子鞭毛表现为大量的弯折和卷曲。以上结果表明,Cfap206-/-小鼠与Cfap206截短变异患者的精子表型相似。进一步使用TEM观察发现,与对照组相比,Cfap206-/-小鼠精子的部分纵切面显示轴突扭曲,可能是导致鞭毛弯折和卷曲的原因。此外,对鞭毛横断面的观察显示鞭毛组织紊乱,如:缺乏外周双联微管和中央微管;双联微管和/或外周致密纤维异常分布等。为了观察CFAP206基因敲除对小鼠胚胎早期发育的影响,我们使用Cfap206-/-小鼠的精子进行ICSI实验。结果显示:与野生型小鼠相比,注射Cfap206-/-小鼠的精子的受精卵,其2-细胞卵裂率和囊胚率均显著降低。结论:SLC26A8基因双等位变异会导致以精子鞭毛线粒体及环缺失为特征的严重弱精子症。SLC26A8基因双等位突变符合隐性遗传模式,与之前认为其可能是显性遗传的相关研究不一致。对于SLC26A8基因双等位变异患者,ICSI助孕可能是一种可行且有效的治疗方法。CFAP206基因双等位截短变异会导致以精子鞭毛多发形态异常为特征的严重弱畸精子症;CFAP206基因双等位变异患者经ICSI助孕失败,以及Cfap206-/-小鼠ICSI实验后获得的低囊胚率,表明Cfap206缺乏可能会影响胚胎的早期发育。