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黄酮广泛存在于植物中并具有多种生物活性,其中槲皮素、山奈酚和黄芩素等作为Nrf2激动剂,研究热度高,表现出多种疾病的干预潜力。氧化应激和炎症反应参与多种疾病的发生与发展,例如支气管哮喘、肺纤维化与慢性阻塞性肺病。核因子E2相关因子2(Nrf2)是调节细胞内氧化还原平衡的关键因子,它能够调控抗氧化酶、Ⅰ相和Ⅱ相药物解毒酶及Ⅲ相药物转运酶基因表达,在氧化应激及炎症调控方面扮演着重要角色。因此,黄酮类Nrf2激动剂的发现是缓解氧化应激和炎症的有效策略,并能够干预支气管哮喘、慢性阻塞性肺病等多种人类疾病的发生和发展。本研究针对两种天然黄酮化合物,探究其对肺部炎症病变有效性及作用机制,研究内容分为以下两个部分:第一部分:查尔酮Artocarmitin B对人肺上皮细胞的保护作用课题组前期研究发现,由ArtocarmitinA(ACA)和反式阿魏酸(FA)酯化形成的查尔酮Artocarmitin B(ACB)能够诱导醌还原酶活性,是潜在的Nrf2激动剂。本研究发现:(1)在无毒剂量下,ACB能够时间和剂量依赖地上调Nrf2、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)的表达,抑制Nrf2泛素化降解,使其半衰期从12.3 min增加至25.1 min,并促进Nrf2转位入核。(2)20 μM ACB预处理显著提高被砷损伤的人肺上皮Beas-2B细胞的生存率,上调细胞内源性还原型谷胱甘肽(GSH)水平,并减少砷诱导的活性氧(ROS)的产生与细胞凋亡率,表明ACB能够增强细胞内的抗氧化能力。(3)ACB诱导的Nrf2激活与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)有关。(4)鉴于ACA和FA均具有Nrf2激动作用,我们比较了 ACA、ACB和FA的活性,发现ACB比ACA和FA单独或联合给药的Nrf2激动作用更强。本研究结果表明,ACB为Nrf2激动剂,并增强了 Beas-2B细胞的抗氧化能力。第二部分:黄酮醇Rhamnazin对肺部炎症的保护作用Physalis alkekengi L.var.franchetii(Mast.)Makino(PAF)作为传统中药在临床上用于治疗咳嗽、喉咙痛、痰多、咽炎等呼吸道疾病已有很长的历史,并且具有良好的效果。实验室前期研究表明,PAF的EtOH提取物具有Nrf2激动作用。本研究发现:(1)来源于PAF的黄酮醇rhamnazin(RN)具有Nrf2激动作用,能够在蛋白和基因水平上调Nrf2、p62、GCLM、血红素加氧酶1(HO-1)的表达,并且6.25 μM或12.5μM RN在蛋白水平上对Nrf2的诱导作用与5μM SF的活性相当,但对Keap1的表达没有影响;RN与Keap1上的半胱氨酸残基Cys151反应,使Nrf2从Keap1上解离,抑制Nrf2泛素化降解,使Nrf2的半衰期从16.69 min增加到35.31 min,并促进其转位入核。(2)采用砷损伤的Beas-2B细胞模型和LPS损伤的小鼠巨噬RAW264.7细胞模型评价RN对细胞内氧化应激的保护作用,研究发现,RN增加了 GSH的表达,并减轻砷和LPS刺激的ROS的生成。(3)采用LPS刺激的小鼠巨噬RAW264.7细胞模型评价RN对炎症反应的抑制作用,RN通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)p65的活化在基因和蛋白水平抑制LPS刺激的炎症蛋白iNOS、MMP-9、COX-2与炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。(4)采用香烟烟雾(CS)诱导的肺损伤小鼠模型分析RN对肺部炎症的防治作用,以叔丁基氢醌(tBHQ)和地塞米松(Dex)为阳性对照药,各组小鼠连续腹腔注射给药10天,每次腹腔注射5h后,模型组与给药组小鼠进行CS损伤。5 mg/kg和10 mg/kg RN处理组显著抑制了CS诱导的血清、肺泡灌洗液、肺组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的过表达,降低肺组织中髓过氧化物酶(MPO)与丙二醛(MDA)的含量,并增加GSH的表达;此外,RN还增加了小鼠肺组织中Nrf2及自噬标志蛋白LC3的含量,并抑制NF-κB p65的表达。(5)本研究还证实,RN诱导细胞自噬,并与RN的抗炎作用有关。综上所述,RN是Nrf2激动剂,并增强了人肺上皮Beas-2B细胞内的抗氧化能力。此外,RN通过抑制NF-κB活化、诱导自噬明显改善肺部损伤。本研究针对两种天然黄酮化合物,首次发现查尔酮ACB为Nrf2激动剂,并揭示了作用机制;发现黄酮醇RN是锦灯笼治疗呼吸道炎症病变的药效物质基础,确证了其体内有效性并从细胞自噬、氧化应激和炎症反应三个方面揭示了分子机制。