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冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]作为我国传统滋补类中药之一,常常被用于治疗肺虚久咳、神疲乏力、喘咳气短等症。现代药理学研究证实,其多糖类、核苷类、甾醇类成分有抗肿瘤、抗炎、抗自由基形成等作用。而从冬虫夏草菌发酵液中提取的抗生素成份ISP-1(myriocin/thermozymocidin)经化学修饰后的合成药物,是一种效果较强的免疫抑制剂,对器官移植等排斥反应的抑制作用尤为突出。冬虫夏草及其相关菌种,是指虫草属真菌包括中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu et Zeng.)以及部分从虫草中分离得到的但尚不能确定其与虫草关系的虫生真菌。目前全世界报道的从冬虫夏草中分离的真菌约有300多种,但多数研究只集中在对其无性型活性成分的分析与鉴定,而对分离出的其它菌种研究极少。冬虫夏草及其相关菌种被认为是最有潜力从中发现新型生物活性化合物或药物先导化合物的真菌类群。固对其多样性的研究,不仅有助于开发高活性生物药物,也可以提高人们对虫草形成过程的认识。本研究主要是通过优化冬虫夏草菌的培养基成分、培养条件以及菌丝体的发酵工艺,比较分离自冬虫夏草的不同真菌菌株虫草腺苷的含量。先通过重复试验和正交法筛选固体培养基添加物的浓度、培养条件,筛选出最佳培养基；进而分离培养采自西藏那曲地区的冬虫夏草,得到冬虫夏草菌及相关菌株；再利用形态和DNA分子鉴定的方法,确定所分离出的菌株种属；最后优化所分离菌株的液体发酵工艺,并测定了相关菌种之间的腺苷含量。主要研究内容及结果如下：(1)从冬虫夏草中共分离出43个不同的真菌菌株,经鉴定子囊菌(Ascomycota)有33株,约占分离菌种的77%,担子菌(Basidiomycete)和未知菌株(Uncultured fungus)各有5株；在子囊菌中又以虫草属(Cordyceps)真菌5株、木霉属(Trichoderma)真菌4株和青霉属(Penicillium)真菌4株为优势菌种。(2)通过对分离菌株菌落特征和显微特征的分析,结合分子生物学对真菌rDNA-ITS上序列的分析,确定了43株真菌菌株的种属。并将虫草属真菌菌株序列与中国弯颈霉(Tolypocladium sinensis C, L, Li.),木霉属真菌和青霉属真菌各一株做进化树,分析其进化关系。(3)筛选培养基并对虫草属真菌和中国弯颈霉的菌丝体进行液体发酵,分别在黑暗和日光条件下培养120h后,称量发酵菌丝体干重,发现黑暗培养可以提高发酵菌株的生物量。Cs-1(Tolypocladium sinense)经两次重复试验在黑暗培养下的菌丝干重平均为1.7g/L,日光培养下为1.25g/L,黑暗培养比正常培养下的菌丝干重重0.35g/L; Cs-4(Hirsutella sinensis)黑暗培养下菌丝干重平均为1.5g/L,日光下为1.35g/L,均比正常培养下的菌丝干重重；Cs-5(Cordyceps nirtolii)黑暗培养下平均为1.9g/L,日光下为1.2g/L,黑暗培养下的菌丝干重比正常培养下的重了0.65g/L; Cs-6(Cordyceps sinensis)黑暗培养下为1.7g/L,日光下为1.45g/L,均比正常培养下的菌丝干重重。(4)确定超声提取腺苷的方法,以80%甲醇,超声提取两次,每次40min,腺苷浓度可达59.63μg/mL;进而利用HPLC对培养基二(葡萄糖25g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,核黄素0.8mg/L, KH2PO40.8g/L, MgSO4·7H2O0.8g/L)液体发酵条件下的四株真菌进行虫草腺苷的检测；结果发现,Cs-1与Cs-6的腺苷含量较为接近,且Cs-1腺苷含量为0.347%略高于Cs-6的0.314%,但两株均低于Cs-4的0.596%；有关Cs-5的腺苷含量研究之前未见有文献报道,但在本实验中其腺苷含量达1.650%,高出中国被毛孢3倍之多,这一发现值得引起人们注意并进一步实验论证。(5)在发酵培养基二中加入氯化铵,记为培养基三(葡萄糖25g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,核黄素0.8mg/L, KH2PO40.8g/L, MgSO4·7H2O0.8g/L, NH4CL5mmoL/L),观察其对不同菌种腺苷含量的影响。结果发现,四株真菌发酵菌丝体的腺苷含量均有不同程度的提高。说明在发酵培养基中加入氯化铵作为合成虫草腺苷的前体物质,可以有效提高发酵菌丝体中虫草腺苷的含量。本实验较系统地研究了冬虫夏草内真菌的物种组成,证实冬虫夏草上生活着许多不同种类的真菌。本研究分离到了前人曾经报道过的真菌菌株：玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus Raillo),中国弯颈霉(Tolypocladium sinense C.Lan Li)和中国被毛孢(Hirsutella sinensis (Berk) Sacc),不仅如此,也首次从冬虫夏草中分离到了虫草属真菌{Cordyceps nirtolii)。通过对不同菌种发酵菌丝体腺苷含量的比较,证实有像Cs-5(Cordyceps nirtolii)这样活性成分明显高于冬虫夏草菌的菌种存在。为寻找可替代带冬虫夏草的真菌菌株以及开发相关新型活性药物提供了理论依据。