北极海洋红球菌(Rhodococcus sp.)B7740类胡萝卜素的提取鉴定及其纳米脂质体的制备

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红球菌(Rhodococcus sp.)B7740冻干粉是学者从北极海水中分离,后经宁波市微生物与环境工程重点实验室培养得到。目前国内外对红球菌(Rhodococcus sp.)B7740的生长环境、代谢繁殖及其分泌物的研究报道很少。本课题结合已有微生物产类胡萝卜素文献的报道,先采用溶菌酶酶解破壁和有机溶剂提取相结合的方法提取类胡萝卜素,然后通过皂化实验、高效液相色谱法对类胡萝卜素初步分离,并结合LC/MS鉴定红球菌B7740类胡萝卜素的结构;考虑到类胡萝卜素的理化性质和生物利用度,采用薄膜分散法制备红球菌B7740类胡萝卜素纳米脂质体,并分析其热稳定性、贮藏稳定性和抗氧化性。主要研究结论如下:(1)红球菌B7740类胡萝卜素的提取优化根据类胡萝卜素紫外可见光谱最大吸收波长下的吸收值(A461)确定红球菌B7740类胡萝卜素的最佳提取溶剂为丙酮/甲醇(7:3,v/v)。通过溶菌酶酶解破壁和有机溶剂提取的单因素实验和正交实验,得到类胡萝卜素提取的最佳条件:先用1mg/m L鸡蛋清溶菌酶(p H6.2 PBS)酶解破壁,按照冻干粉与溶菌酶缓冲液物料比1/150(m/v)在40℃酶解温度下破壁90min;离心分离得下层沉淀,按冻干粉与提取溶剂1/250(m/v)的物料比在40℃温度下提取90min,离心得到上清液即为类胡萝卜素粗提液。提取类胡萝卜素含量约1mg/g,一次提取率达88.15%。(2)红球菌B7740类胡萝卜素的分离与鉴定皂化会促使类胡萝卜素含量增加,这可能是类胡萝卜素酯或酸在皂化体系中发生分解,同时游离类胡萝卜素的降解减少,从而游离类胡萝卜素含量增加;使用甲醇+MTBE(1:1,v/v)作为进样溶剂进行高效液相色谱(HPLC)分离得到38个色谱峰,初步鉴定含有β-胡萝卜素。通过液相色谱/质谱分析,发现提取的类胡萝卜素属于甲基萘醌类,经过鉴定得到以下6种物质:MK8(H2)和MK8(H4)、MK7(H2)和MK7、C40H56O2和C46H64O2。这几种物质都是由8个异戊二烯和一个甲基萘醌环组成,不同于常见类胡萝卜素的结构组成。(3)红球菌B7740类胡萝卜素纳米脂质体的制备和表征通过对超声时间、超声功率、类胡萝卜素载量和缓冲液p H的优化,得到制备纳米脂质体的最佳条件:取载量为1.0%的类胡萝卜素和L-α-卵磷脂、吐温80(L-α-卵磷脂与吐温80的质量比为1:0.72),三者完全溶解在7m L氯仿中;采用薄膜分散法减压蒸发60min除去氯仿,转移至烧杯中水化搅拌60min;然后用240w功率超声30min,静置一段时间,得到类胡萝卜素纳米脂质体。该脂质体的平均粒径为50nm,多分散系数(PDI)小于0.3,类胡萝卜素包埋率为96.5%。将脂质体分别在4℃、37℃和80℃恒温条件下贮藏,以空白脂质体作对照,发现类胡萝卜素脂质体有一定的热稳定性和贮藏稳定性,能在37℃下贮存3d,耐80℃高温2d,在4℃下可保持稳定18d。通过对清除DPPH自由基能力和还原铁能力的测定发现,类胡萝卜素脂质体的抗氧化性明显高于类胡萝卜素原液和β-胡萝卜素标品液。
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