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第一部分HL60-C3AR1稳转细胞株鉴定目的:验证前期试验中构建的HL60-C3AR1,为研究该基因在HL60细胞株中的生物学功能奠定基础。方法:1.利用流式细胞仪检测HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60 GFP表达水平;2.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60总RNA,逆转为c DNA,通过定量PCR方法,利用SYBR Green染料特异扩增C3AR1基因片段,进行定量分析。3.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60膜蛋白,western方法检测两株细胞C3AR1蛋白表达水平。结果:绿色荧光蛋白GFP在HL60-C3AR1及HL60-Venus表达水平都大于98%;经定量PCR检测,HL60-C3AR1细胞C3AR1基因m RNA表达水平较HL60-Venus及亲本株HL60细胞显著升高;Western结果显示,C3AR1基因蛋白水平在HL60-C3AR1细胞显著高于HL60-Venus及亲本株HL60。结论:C3AR1基因在HL60-C3AR1细胞株稳定高表达,为研究C3a R1基因在HL60细胞中的功能奠定了基础。第二部分高表达C3AR1基因促进HL60细胞发生迁移及侵袭目的:探讨C3AR1对人早幼粒白血病细胞株(Human promyelocytic leukemia cells,HL60)迁移及侵袭的作用和机制。方法:1.在加入或不加C3a和SDF-1条件下,利用transwell小室对HL60-C3AR1及HL60-Venus细胞进行迁移及侵袭实验;2.利用流式细胞术检测CXCR4蛋白的表达水平,确定是否与CXCR4蛋白表达变化有关系;3.利用PCR ARRAY,筛选上调和下调的基因,进一步探讨其可能的发生机制。结果:高表达C3AR1的HL60细胞,在C3a和SDF-1的作用下,细胞迁移及侵袭能力较转染空载体细胞明显增多。PCR ARRAY发现了包括CCL2在内的16个基因显著上调,4个基因显著性下调,但与CXCR4的表达无关。结论:C3a和SDF-1促进高表达C3AR1细胞迁移和侵袭是通过调控CCL2等迁移相关基因实现的。第三部分探讨C3AR1基因促进HL60细胞对拓扑异构酶Ⅱ毒剂依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐药性及其机制目的:探讨C3AR1基因促进HL60细胞对依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐药性及其可能的机制。方法:1.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以不用浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h、48h、72h,CCK8法检测细胞存活率。观察C3AR1对HL60对上述三种化疗药药物敏感性的影响。2.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以不用浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h,Annexin V-PE/7-AAD法检测细胞凋亡水平;3.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以适当浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h,48h,Hoechst 33342染色检测细胞核形态变化;4.分别用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌以适当浓度处理细胞24h后,提取总RNA,逆转为c DNA,进行凋亡PCR ARRAY检测,找出上调及下调基因探究其可能发生的机制;5.Western Blot检测共同下调及共同上调的基因,进一步验证其可能的机制;结果:加药实验显示HL60-C3AR1对依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药表现出明显耐药性;凋亡实验显示,加不同浓度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分别处理24h,HL60-C3AR1凋亡水平较HL60-Venus显著降低;Hoechst 33342染色显示加适当浓度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分别处理24h、48h显示HL60-C3AR1细胞核碎裂情况较HL60-Venus细胞显著降低;凋亡PCR ARRAY筛选出不同上调与下调基因,其中有BIRC7、SOCS2、LCK三个共同下调基因;western检测HL60-C3AR1细胞BIRC7、SOCS2、LCK表达水平较HL60-Venus细胞明显降低。进一步研究发现,C3AR1高表达的HL60-C3AR1细胞株加药处理后,线粒体凋亡途径蛋白发生了改变,抗凋亡蛋白BCL-XL,BCL2表达水平上调,而促凋亡蛋白Bax,Bad表达水平下调结论:C3AR1通过调控BIRC7、LCK、SOCS2等基因进一步通过线粒体途径介导了HL60对TOPOⅡ毒剂VP16、阿霉素、米托蒽醌产生耐药。