动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）性心血管疾病是一类严重危害人类健康的疾病，其发生机制涉及脂质代谢异常、炎症、氧化应激等众多因素。单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬脂蛋白源性的胆固醇，从而在血管壁上形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化发病过程中一个最主要的事件。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是一种整合膜蛋白，它在细胞内胆固醇代谢过程中起着十分重要的作用。ABCA1以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂流出，结合到细胞表面的载脂蛋白A-I（apoA-I），从而调节细胞内胆固醇稳态。研究表明，ABCA1不仅在HDL合成和胆固醇逆向转运过程中起重要作用，而且是抑制动脉粥样硬性心血管疾病的一个潜在靶标。晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products，AOPPs），主要是由血浆蛋白被次氯酸修饰而形成，是一种新的氧化损伤标志物。临床和基础研究均提示AOPPs可能在促动脉粥样硬化发展方面起着十分重要的作用，并有研究者提出AOPPs是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素，但是AOPPs致动脉粥样硬化的分子机制尚不清楚。有研究认为AOPPs可增加动物模型体内动脉粥样硬化病变，增加斑块处氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的沉积、巨噬细胞浸润和平滑肌细胞增殖，提示AOPPs不仅只是氧化应激的标志物，可能与脂质代谢相关。Janus激酶(JAK)和转录激活子(STAT)途径是一种重要的细胞信号转导途径。JAK/STAT信号途径是一种应激反应信号级联放大的信号途径，它可以介导信号从细胞表面受体转导至细胞核，从而调节相关基因的表达。许多血管应激因子都可以通过JAK/STAT信号途径的活化而产生血管疾病，并且JAK/STAT信号途径也是动脉粥样硬化性血管损害的关键调控途径。有研究发现JAK/STAT1信号途径与肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）、ABCA1表达及细胞内胆固醇流出密切相关。本课题组前期研究也发现JAK/STAT1信号途径是干扰素γ（IFN-γ）下调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的关键信号传导途径，阻断JAK/STAT1信号途径明显上调ABCA1的表达并促进细胞内胆固醇流出。本研究从调节胆固醇稳态的关键分子——ABCA1入手，并通过不同方法干预JAK/STAT1信号途径，观察其对AOPPs作用的影响，以探讨AOPPs与ABCA1之间的作用关系及信号传导机制，从而为揭示AOPPs在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用和机制提供新的研究思路。第一部分AOPPs对THP-1巨噬细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响目的：观察AOPPs对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响，同时观察胆固醇逆向转运中的关键分子——ABCA1表达的变化。方法：培养THP-1细胞株，以佛波酯(PMA)和oxLDL诱导分化并形成泡沫细胞，复制巨噬细胞源性泡沫细胞模型。以AOPPs处理细胞，观察AOPPs对胆固醇流出及ABCA1表达影响的浓度效应和时间效应。以液体闪烁计数法、油红O染色及高效液相色谱法分别检测细胞内胆固醇的流出、脂滴及胆固醇含量。采用实时定量PCR、Western blotting免疫印迹分别检测细胞中ABCA1mRNA和蛋白质的表达。结果：不同浓度的AOPPs（0，50，100，200μmol/L）处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后，液体闪烁计数法检测显示，细胞内胆固醇流出减少。高效液相色谱法检测发现，细胞内胆固醇含量明显增加，而油红O也显示细胞内脂滴明显增加，并且AOPPs的作用呈浓度依赖性。对ABCA1表达的检测结果显示，AOPPs可使细胞ABCA1mRNA和蛋白的表达下调，作用效应也呈浓度依赖性。以100μmol/LAOPPs分别处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞不同时间（0，12，24，48小时），经检测发现，细胞内胆固醇流出减少，细胞内胆固醇含量明显增加，细胞内脂滴明显增加，且随时间的延长，效应越明显，提示AOPPs的作用呈时间依赖性。实时定量PCR、Western blotting免疫印迹检测发现细胞中ABCA1mRNA和蛋白质的表达也呈时间依赖性下调。结论：①AOPPs呈时间和浓度依赖性抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的流出，增加细胞内胆固醇的蓄积；②AOPPs呈时间和浓度依赖性抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达。第二部分AOPPs抑制THP-1巨噬细胞ABCA1表达的机制目的：探讨AOPPs抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达和减少细胞内胆固醇流出的可能分子机制。方法：培养THP-1细胞株，以佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和ox-LDL诱导分化并形成泡沫细胞，复制巨噬细胞源性泡沫细胞模型。采用AOPPs和（或）LXRα、JAK/STAT1信号途径中关键分子的相关激动剂、抑制剂、RNA干扰等因素共同处理细胞，以液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出率，采用实时定量PCR、Western blotting免疫印迹分别检测细胞中ABCA1、LXRα mRNA和蛋白质的表达，并检测STAT1和JAK2磷酸化蛋白的表达。结果：分别采用AOPPs和（或）LXRα激动剂22(R)-Hch、LXRα siRNA处理细胞，结果显示，与对照组比较，22(R)-Hch能明显上调细胞ABCA1的表达，而采用LXRα siRNA转染细胞后发现，LXRα siRNA下调细胞ABCA1、LXRα的表达；与单独用AOPPs处理组细胞比较，AOPPs与22(R)-Hch共处理组细胞ABCA1的表达上调，而AOPPs与LXRα siRNA共处理组细胞ABCA1、LXRα的表达则下调。液体闪烁计数法检测显示，与单独用AOPPs处理组细胞胆固醇流出率比较，AOPPs与22(R)-Hch共处理细胞的胆固醇流出率增加，而AOPPs与LXRα siRNA共处理组细胞胆固醇流出率减少。经Western blotting免疫印迹检测发现，AOPPs处理细胞15分钟后，STAT1的酪氨酸（tyrosine，Tyr701）磷酸化增加，60分钟更为明显。采用STAT1siRNA转染细胞并用AOPPs处理后，其ABCA1、LXRαmRNA和蛋白质的表达上调（与单独用AOPPs处理的细胞比较）。液体闪烁计数法检测显示，与AOPPs单独处理组比较，STAT1siRNA与AOPPs共同处理细胞的胆固醇流出率增加。JAK抑制剂AG-490与AOPPs共同处理细胞后，细胞中ABCA1、LXRα mRNA和蛋白质的表达高于单独用AOPPs处理组的细胞，而胆固醇的流出率也高于单独用AOPPs处理组细胞。与单独用AOPPs处理组细胞比较，NADPH氧化酶抑制剂DPI与AOPPs共同处理细胞后，细胞JAK2磷酸化减少，而细胞ABCA1、LXRα mRNA和蛋白质的表达则上调，胆固醇的流出增加。结论：①AOPPs通过调控LXRα的表达，从而抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达和胆固醇流出；②AOPPs经JAK/STAT信号途径调节ABCA1的表达及细胞胆固醇流出；③AOPPs经NADPH氧化酶影响JAK/STAT信号途径的活化。第三部分AOPPs对apoE基因敲除小鼠As病变及ABCA1表达的影响目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠为研究对象进行体内研究，观察AOPPs对apoE KO小鼠ABCA1表达、动脉粥样硬化病变及脂质蓄积的影响，初步探讨其作用机制。方法：8周龄雄性apoE-KO小鼠以高脂/高胆固醇（high-fat/high-cholesteroldiet，HF/HC，15%猪油+0.25%胆固醇）饲料饲养，小鼠随机分为四组（每组10只）。其中，对照组仅饲以高脂/高胆固醇饮食，隔天腹腔注射与实验组同等剂量的生理盐水；AOPPs组除饲以高脂/高胆固醇饮食外，隔天腹腔注射AOPPs（剂量5mg/kg）；AG-490组除饲以高脂/高胆固醇饮食外，隔天腹腔注射AG-490（剂量5mg/kg）；AOPPs+AG490组除饲以高脂/高胆固醇饮食外，隔天腹腔注射AOPPs和AG-490（剂量均为5mg/kg）。采用全自动生化分析仪进行酶法测定血脂；HE染色和油红O染色分别观察主动脉窦处动脉粥样硬化病变及脂质蓄积情况，同时观察肝脏结构变化及脂质蓄积情况；以实时定量PCR、Western blotting免疫印迹和免疫组织化学方法检测小鼠主动脉、肝及小肠组织的ABCA1、LXRα mRNA和蛋白质的表达。结果：结果显示，与对照组比较，AOPPs组小鼠血脂水平升高，主动脉窦处病变面积增大，油红O染色显示主动脉窦处病变组织脂滴增加较明显；而与AOPPs组小鼠比较，AOPPs+AG490组小鼠的血脂水平降低，主动脉窦处病变减轻，油红O染色显示主动脉窦处病变组织的脂滴减少。同时，光镜下可见各组小鼠的肝脏组织结构都有不同程度损害，结构排列较紊乱，其中AOPPs组小鼠肝脏组织破坏较为严重，脂肪空泡也较明显，油红O染色显示其肝脏组织中脂滴增加；而AOPPs+AG-490组小鼠肝脏结构的破坏程度相对较轻，油红O染色可见其肝脏脂滴减少（与AOPPs组小鼠比较）。此外，小鼠主动脉、肝、小肠组织的ABCA1和LXRα表达检测发现，与对照组比较，AOPPs组小鼠ABCA1和LXRα的表达下调；而与AOPPs组比较，AOPPs+AG-490组小鼠ABCA1和LXRα的表达上调。结论：①AOPPs增加apoE-KO小鼠体内脂质蓄积，促进其动脉粥样硬化病变的发展；②AOPPs可以下调apoE-KO小鼠主动脉、肝脏、小肠和腹腔巨噬细胞ABCA1、LXRα的表达；③JAK抑制剂AG-490可抑制AOPPs对ABCA1表达的影响。