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目的:研究ClC-3(voltage-gated chloride channel 3)氯通道蛋白调控P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导肿瘤细胞耐药的分子机制,确定ClC-3是通过NF-кB信号通路来调控P-gp的表达,为进一步研究ClC-3在肿瘤中的作用以及基于逆转肿瘤耐药的肿瘤治疗提供靶点及理论依据。方法:(1)Western blot检测人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR中NF-кB P65、IкBα、IKKα、IKKβ的表达。(2)MCF-7细胞转染ClC-3表达质粒(pcDNA3.1/ClC-3)增强ClC-3的表达,Western blot检测过表达ClC-3后的细胞NF-кB P65、IкBα、pIкBα/ser 32、IKKα、IKKβ的表达。(3)细胞免疫荧光检测MCF-7细胞的ClC-3表达增加后对NF-кB P65核转移的影响。(4)双荧光素酶报告基因系统(p-NF-κB-luc和pRL-TK-Vector)检测MCF-7细胞的ClC-3表达增加后对NF-κB转录活性水平的影响。(5)MCF-7细胞用脂多糖LPS刺激或转染P65 Si RNA后,双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB转录活性水平,荧光定量PCR和Western blot检测NF-κB转录活性改变对MDR1 mRNA和P-gp表达的影响。(6)MCF-7细胞ClC-3表达增加后,再转染P65 Si RNA抑制NF-κB信号通路,荧光定量PCR和Western blot检测对MDR1 m RNA和P-gp表达的影响。(7)MCF-7细胞上调ClC-3表达后再抑制NF-κB信号通路(转染P65 Si RNA),MTT法检测抗癌药物紫杉醇对干预后细胞增殖的影响。结果:(1)MCF-7/ADR细胞的IKKα、IKKβ、NF-кB P65蛋白表达量明显高于MCF-7细胞,IкBα表达量则降低。(2)上调MCF-7细胞ClC-3的表达量,其IKKα、IKKβ、NF-кB P65、p IкBα/ser 32蛋白表达量明显增加。(3)上调MCF-7细胞ClC-3的表达量后,NF-кB P65蛋白从细胞质基质中转移到细胞核中。(4)ClC-3能作用于NF-кB P65靶位点,转染后增加NF-кB P65相对萤光素酶值,提高转录活性水平。(5)LPS激活MCF-7细胞NF-κB信号通路,上调MDR1 mRNA和P-gp的表达;P65 Si RNA抑制NF-κB信号通路,下调MDR1 mRNA和P-gp的表达。(6)增加MCF-7细胞ClC-3表达的同时抑制NF-κB信号通路,MDR1 m RNA和P-gp的表达被抑制。(7)上调MCF-7细胞ClC-3的表达,紫杉醇对细胞增殖抑制作用明显减弱;上调MCF-7细胞ClC-3的同时下调NF-кB P65的表达,则逆转ClC-3高表达引起的紫杉醇对细胞增殖抑制作用的降低。结论:在乳腺癌细胞中ClC-3通过NF-кB信号通路调控P-gp的表达,从而介导肿瘤细胞发生耐药。