目的:　　股骨头坏死(Avascular Necrosis of Femoral Head，ANFH))是由于多种病因造成股骨头血液循环障碍，部分或完全性缺血，导致骨细胞、骨髓造血细胞、脂肪细胞等活力成分变性和死亡，骨小梁断裂，坏死区的力学强度逐渐下降，引起股骨头塌陷，最终形成严重的骨关节炎。髋关节创伤、激素过量使用和乙醇中毒是股骨头坏死常见的病因。近年来，随着对股骨头坏死研究的不断深入以及骨髓干细胞的应用，使股骨头坏死的治疗有了新的进展。　　骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMSCs)来源于中胚层，具有多向分化潜能。在特定的条件下，可定向分化为骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞等。同时还可分泌多种成骨活性因子，与骨组织再生和创伤愈合创造了有利条件，体内外研究显示在骨与软组织损伤修复方面显示出良好应用前景。同时，动物实验已证实:全身或局部注入人胚胎骨髓间充质干细胞和自体骨髓间充质干细胞很少发生移植排斥反应。由于外源性生长因子半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢，须反复使用，从而带来一些问题。转基因技术可在不影响细胞特殊表型的前提下，将编码生长因子的基因导入目的细胞中。有研究通过基因表达产生内源性生物活性物质，调控细胞自身增殖分化，将细胞治疗和基因治疗结合起来，应用于组织工程修复股骨头坏死过程，提出了基因加强的组织工程(gene-enhanced tissue engineering)新理念。近年来，已有较多将单一生长因子转入种子细胞并取得较高表达和较好效果的报道。转基因骨髓间充质干细胞的出现明显提高了干细胞治疗股骨头坏死的疗效。　　骨形态生成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是一类酸性多肽，属于TGF-β超家族结构相关信号蛋白，能诱导未分化的间充质细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，具有诱导新骨形成的作用，是目前最重要的新骨形成调控因子，主要由成骨细胞和瘤性成骨细胞分泌。骨形态生成蛋白能促进多种细胞的增殖和分化，如成骨细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，并能诱导骨基质的合成，在体外可促进骨髓基质细胞的增殖，增强其碱性磷酸酶活性，刺激其分化。BMP-2在体内，主要分布于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中，密质骨的含量较松质骨多。BMP-2是骨形成过程中惟一能独立诱导间充质干细胞分化为骨细胞的调控因子。研究表明，低浓度的BMP-2可诱导间充质干细胞移行至骨组织形成部位;中等浓度的BMP-2能促进间充质干细胞分化为成软骨细胞及成骨细胞;高浓度的BMP-2则可促进间充质干细胞增生。在临床上，骨髓间充质干细胞(BMSCs)取自于骨髓，手术操作简便，来源较充足。大量研究表明，BMP-2与BMSCs在新骨生成过程中具有协同作用。本实验将BMP-2基因转染入BMSCs，观察转染的BMSCs中BMP-2 mRNA和蛋白质水平。分析BMP-2基因转染在体外向成骨方向分化的情况。　　采用植入钽和钽合金减压金属棒的方法是目前临床上治疗早期股骨头坏死的一种方法。但镁和镁合金的弹性模量和密度比钽合金更接近骨组织的物理学性质，具有比其他生物金属材料密度小的优点。它的密度接近人体骨组织密度，镁及镁合金和人体骨的弹性模量分别为45 GPa和3～20 GPa，由于相近的弹性模量镁及镁合金可以减少应力遮挡效应，减少局部骨质疏松的发生和再骨折现象。由于金属镁及镁合金无磁性，当人体携带镁及镁合金时可以进行核磁共振成像造影，这是金属镁及镁合金在临床应用的优势之一。更重要的是，镁对人体的很多的新陈代谢有积极作用。在高氯离子的环境和动物体内，镁和镁合金材料有良好的生物降解性。镁是人体新陈代谢重要的原材料，主要通过小肠吸收，在人体中有很多重要的生理功能，是人体中许多酶的辅因子，它能抑制钙离子在人体内的积累，使血液中胆固醇含量降低，对动脉粥样硬化和心肌梗塞有一定的预防作用，并且它还能改善心脏的功能，稳定生物体内DNA和RNA的结构。高浓度的镁具有毒性，血清镁水平超过1.05mmol/L可能导致肌肉瘫痪、低血压、呼吸窘迫。综上所述，镁合金良好的力学特性、生物学相容性、可降解性和生物活性特征成为新型医用植入材料的明星材料。　　本实验将骨形态生成蛋白-2（Bone Morphogenetic protein-2，BMP-2）转染骨髓问充质细胞(bone morrow mesenchymal stem cell，BMSCs)，复合镁合金金属棒植入兔股骨头坏死模型病变部位，通过术后定期检测动物生化指标、组织学形态、影像学改变，从而评价镁合金和骨髓间充质干细胞复合骨形态生成蛋白治疗兔股骨头坏死的效果和镁合金作为植入材料的安全性和有效性。　　方法:　　1.液氮冷冻法建立股骨头坏死模型所有实验用动物均以右侧股骨头建立坏死模型。参照临床上人股骨头髓芯减压术的操作步骤，取俯卧位，采用质量分数3％戊巴比妥腹腔注射(30mg/Kg)的方法进行麻醉;确定股骨头位置后取外侧切口，切开关节囊，充分暴露外旋股骨头（以未出现髓关节脱位为准），然后从外背侧向股骨头方向直至关节软骨下钻孔，所用钻头直径为3.5 mm，采用刮匙刮除股骨头内骨质的方法造成约50％左右的骨缺损，最后用液氮灌注法持续冷冻股骨头大约5 min。　　2.BMP-2转染BMSCs及鉴定成年新西兰大耳白兔髂后上嵴抽骨髓组织，种植于细胞培养板内，置于DMEM培养基中，37℃、体积分数5％ CO2孵箱内贴壁培养。取培养的第三代细胞，分离鉴定BMSCs，采用电转法将BMP-2基因表达载体转染至BMSCs细胞。细胞转染后分成2组，采用反转录RT-PCR检测各组BMSCs的BMP-2基因的mRNA表达水平;采用Western-blot法检测各组BMSCs的BMP-2蛋白表达水平。随后复合于明胶海绵上，在细胞培养箱中孵育4h后备用。　　3.动物分组用X线片鉴定动物模型，随机分成空白组（A组）、BMSCs组（B组）、镁棒/BMSCs组（C组）、镁棒组（D组）4组，每组10只。动物麻醉成功后，空白组不做处理，BMSCs组植入转染成功的BMSCs，镁棒/BMSCs组植入镁棒和转染后的BMSCs，镁棒组植入镁棒。所有动物均用右侧股骨头实验。　　4.植入后第6周、第12周观察兔股骨头修复情况于第6周和第12周每组取两只动物行HE染色及Masson染色观察骨小梁生长状态。　　5.植入后第6周、第12周实验动物的肝、肾、肺毒性及化验检查用HE染色对兔肝、肾、肺组织进行组织病理学观察。用生化法检测动物血、尿标本的镁离子浓度。　　结果　　1.BMP-2基因转染及表达鉴定 Western-blot法和RT-PCR法检测结果显示，外源性BMP-2基因通过体外电转成功转染BMSCs并表达相应的mRNA及蛋白。　　2.动物模型股骨头X线检查结果　　A组标本:术后6周时，模型侧股骨头密度降低，骨小梁结构紊乱;术后12周时，股骨头密度增高，骨小梁结构不清，软骨下囊性变。B组标本:术后6周、12周时，骨组织只在钻孔区边缘密度增高，而钻孔区内骨组织密度无明显变化。C组标本:骨修复效果明显较A组、B组好，股骨头外形恢复良好，骨密度亦降低;术后12周时钻孔区密度接近周围骨质，股骨头内出现规则连续骨小梁，钻孔边缘交界区骨小梁接合良好。D组标本:在6周和第12周时，股骨头可见明显的骨修复，但骨密度较低。　　3.股骨头组织切片观察　　A组标本:术后6周时，模型侧ANFH部位出现较多破骨细胞，骨小梁形状不规则，关节软骨面磨损严重，少数模型的关节软骨面出现塌陷;术后12周时，关节软骨而磨损现象与修复现象并存，骨髓纤维化和增生同时可见，骨吸收和软骨面塌陷被发现。B组标本:术后4周时，骨缺损处成骨细胞稀少，进而仅钻孔区逐渐形成骨髓组织，钻孔边缘出现少量类骨质及新生骨小梁。16周时其软骨面的磨损、骨小梁的紊乱以及股骨头的塌陷都与模型对照组相似。C组标本:术后6周时，骨小梁排列基本规则，有大量的骨细胞形成;术后12周时，可见骨小梁排列规则，饱满，骨细胞清晰可见，造血细胞丰富，已为正常股骨头组织学表现。D组标本:对于镁棒组（D组）骨小梁骨密度较低，仅略高于空白组的骨密度。　　4.实验动物的肝肾肺毒性及化验检查　　第6周和第12周兔肝组织HE染色镜下观察大部分肝细胞组织形态正常、肝小叶结构正常;取兔肾组织镜下观察未见肾小管细胞坏死，肾小球组织形态正常取兔肺组织行HE染色镜下观察肺组织组织形态正常、未见肺纤维化。术后第6周和第12周镁棒组和镁棒/BMSCs组静脉血、尿样本的镁离子浓度均在正常范围内。　　结论:　　1.体外电转重组BMP-2表达载体至BMSCs，细胞毒性低，不影响其在支架材料上的增殖和成骨分化。　　2.BMP-2基因转染BMSCs复合镁金属棒，可促进兔股骨头的坏死组织骨小梁形成的成骨作用。　　3.镁合金棒具有良好的生物相容性。