论文部分内容阅读
研究目的本研究通过比较传统低剂量化疗方案联合和不联合芪附扶正合剂(Modified Qifu Fuzheng Decoction,QFFZD)治疗老年急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)(非M3)的相关临床指标,包括缓解率、中医症候积分、复发率、生存率及感染发生率等,客观评价QFFZD在老年AML治疗中的临床疗效和安全性。再通过体外实验探讨QFFZD协同阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响,并探寻其分子学作用机制,为临床QFFZD辅助治疗AML提供科学依据。研究方法临床研究方法:根据患者治疗期间是否联合口服芪附扶正合剂中药,将58例老年AML患者分为观察组(30例)和对照组(28例),观察组予低剂量传统化疗方案联合QFFZD口服,对照组仅予低剂量传统化疗方案治疗。比较两组患者的CR率、诱导治疗后中医症候积分变化情况、复发率、中位生存期、总生存率;同时比较两组患者诱导期感染发生率及远期感染发生率。实验研究方法:(1)采用20只SD雄性大鼠,适应性饲养后随机分为对照组与QFFZD治疗组,分别予2mL生理盐水和2mL生药浓度为1.68 g/mL QFFZD灌胃,连续7天。第8天麻醉后主动脉取血,分离得到上层血清,-80℃保存备用;2.采用MTT比色分析法检测不同浓度QFFZD含药血清、Ara-C单用和联合干预HL-60细胞24h和48h后对其的增殖抑制作用;(3)PI单染流式细胞术(FCM)用于检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞细胞周期的影响;(4)Annexin V/PI双染流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞的凋亡诱导作用;(5)免疫印迹实验(Western Blot,WB)检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞凋亡相关蛋白兔Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)及其剪切体cleaved caspase-3、cleaved PARP以及Akt/p53信号通路相关蛋白的表达情况;(6)免疫印迹实验被用于检测Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL干预HL-60细胞后凋亡相关蛋白的表达情况。结果临床研究结果:观察组和对照组的CR率分别为66.7%、60.7%,差异无统计学意义(p>0.05);在诱导化疗结束后改善中医症候积分方面,观察组明显优于对照组(p<0.05);观察组的复发率略低于对照组,分别为55.0%和58.8%,但差异无统计学意义(p>0.05);在远期生存方面,观察组和对照组的估计中位生存期分别为21.818.7个月和16.8±5.7个月,1年生存率分别为(60.3±9.4)%和(56.7±9.4)%,3年生存率分别为(39.0±9.8)%和(27.2±9.6)%,5年生存率分别为(27.9±9.7)%和(20.4±9.3)%,均未达到统计学差异(P=0.213);在不良反应方面,观察组诱导期感染发生率(46.7%)与对照组(46.4%)相差不大;观察组远期的感染发生率(28.0%)低于对照组(34.9%),差异有统计学意义(p<0.05)。实验研究结果:1.MTT比色分析法结果显示,相同干预时间下,QFFZD含药血清(2%、4%、6%、8%、10%)和 Ara-C(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)单用以及联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用均呈浓度依赖性,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05);不同浓度QFFZD含药血清和Ara-C单独和联合干预HL-60细胞24h和48h后,其对细胞的增殖抑制作用随着干预时间的延长而增强,差异具有统计学意义(p<0.05);此外,相同干预时间下,二者联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用与二者单独使用对细胞的增殖抑制作用相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.PI单染流式细胞术结果显示,与对照组相比,QFFZD含药血清(10%)和Ara-C(8μmol/L)单独以及联合干预HL-60细胞24h后,均能将HL-60细胞阻滞于G1期,两药联合时对HL-60细胞的周期阻滞作用更加明显(p<0.05)。3.流式细胞术检测QFFZD含药血清(10%)和Ara-C(8μmol/L)单独以及联合干预HL-60细胞24h后细胞的凋亡率。结果显示,单用以及联合使用均能诱导细胞发生凋亡,并且两药合用时凋亡效果更加明显(p<0.05)。4.QFFZD含药血清(10%)和Ara-C(8μmol/L)单独以及联合干预HL-60细胞24h后,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达情况,结果显示,促凋亡蛋白Bax以及执行凋亡程序的关键蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达均明显高于空白组(p<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则低于空白组(p<0.05)。与此同时,Akt/p53信号通路相关蛋白p-Akt的表达水平各给药组明显低于空白组(p<0.05),而p53的表达水平各给药组则明显高于空白组(p<0.05)。5.在用QFFZD含药血清(10%)和Ara-C(8 μmol/L)共同干预HL-60细胞前,予Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL(5 nmol/L)预处理24h后,以Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示,Akt特异性抑制剂预处理后,凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达明显降低(p<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则有所升高(p<0.05)。结论临床研究表明,QFFZD联合低剂量传统化疗方案治疗老年AML较单纯应用化疗有一定优势,尤其体现在可以改善中医症候积分,降低远期感染发生率;随着服药时间的延长,一定程度上可延长中位生存期,提高3年及5年生存率的趋势(虽未达到统计学差别)。实验研究表明,1.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能以浓度和时间依赖的方式有效地抑制HL-60细胞的增殖,而且表现出两者之间可能存在协同或叠加效应。2.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能明显地提高处于G1期的HL-60细胞比率,同样表现出明显的协同作用。3.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷可诱导HL-60细胞发生凋亡,其过程可能是通过调控Akt/p53信号通路从而启动内源性细胞凋亡途径发挥作用。