非线性光学显微成像主要包含多光子显微成像和相干拉曼散射显微成像,其具有高三维空间分辨率、低离焦光漂白及高图像信噪比等优点。相较其他光学显微成像方式而言,非线性光学显微成像可以获得样品更丰富的形态、结构及分子信息。如何在一台非线性光学显微镜中同时实现多种成像模式（例如多波长激发、多焦平面等）,始终是非线性光学显微成像领域的研究热点,但传统的同步和非同步方法分别存在信号串扰和图像失配的问题。本文将通信系统中避免多组数据同步传输时产生数据串扰的时分复用技术与非线性光学显微成像相结合,在消除信号串扰的同时实现了图像自动配准,拓展了非线性光学显微成像在生物医学领域的应用前景。为了开展非线性光学显微成像研究,在理论上分析了非线性光学效应中的双光子荧光（two-photon fluorescence,TPF）、二次谐波（second-harmonic generation,SHG）和相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS）过程,讨论了不同非线性效应的优势与存在的问题,并阐述了非线性光学显微成像广泛采用的激光扫描显微镜的工作原理与技术要点。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）是生物细胞内两种重要的荧光辅酶,通过TPF信号观察二者的相对浓度与空间分布可以研究细胞代谢过程,但传统显微成像方法存在图像失配和谱间串扰的弊端。本文利用时分复用和脉冲整形方法构建了同步多色激发TPF显微成像系统,消除了图像失配的可能,并将传统方法中NADH对FAD约40%的谱间串扰与FAD对NADH约4%的谱间串扰均降至0.4%以内。文中首先描述了脉冲整形器、时分复用光路与激光扫描显微镜的构建过程与工作原理;随后进行的稳定性与谱间串扰测试证明了系统的良好性能;最后对小鼠结肠黏膜进行了NADH/FAD同步激发TPF显微成像实验,实验结果清晰地揭示了NADH和FAD的分布与相对浓度,以及小鼠结肠黏膜由柱状结肠细胞和隐窝构成的微环境,进一步验证了系统的有效性。多焦平面多光子显微成像增加了成像维度,能够获取更为丰富的生物组织形态与结构信息,但传统方法存在图像失配和谱间串扰的弊端。本文利用时分复用和遥控聚焦方法构建了同步多焦平面多光子（TPF与SHG）显微成像系统。该系统消除了图像失配的可能,并将传统方法约5%的信号串扰降至0.4%以内。文中首先分析了遥控聚焦的优势,并描述了遥控聚焦、时分复用光路与激光扫描显微镜的实现方法;随后通过测试确定遥控聚焦方法有效地降低了球差对成像质量的影响,当焦平面轴向调节至±100μm时,系统仍具有接近衍射受限的分辨率;通过测试确定了信号串扰可以忽略不计;最后对小鼠肺泡区和结肠进行了显微成像实验,清晰地揭示了小鼠肺泡区胶原蛋白纤维与弹性蛋白纤维螺旋缠绕所形成的复合结构,实现了对肺泡腔体和结肠黏膜固有层内巨噬细胞的三维定位,验证了系统的有效性。由于受到非共振背景的强烈干扰,CARS显微图像的质量严重下降。本文利用时分复用和三通道时间透镜光源构建了同步非共振背景抑制CARS显微成像系统,解决了非共振背景抑制缺乏高性能多色皮秒光源的问题。时间透镜光源是一种基于光纤的非锁模脉冲激光光源,其具有鲁棒性强、操作简便、波长调节范围大、平均功率高等诸多优点,而且可以与Ti:sapphire激光器自动同步（时间抖动仅为约50 fs）,能够覆盖0–4000 cm-1的拉曼频移。文中首先介绍了泵浦光源、三通道时间透镜光源、激光扫描显微镜的构建过程;随后对泵浦光与斯托克斯光的参数进行了详细测试;最后对浸水棉纤维进行了同步非共振背景抑制CARS显微成像实验,结果表明三通道时间透镜光源能够同时使用两种非共振背景抑制方法,并可将图像对比度分别提升约8倍和11倍。CARS光谱显微成像能够同时生成图像与光谱,其中的同步多色探测方法采用窄带皮秒脉冲作为光源,与其它方法相比,它具有光谱分辨率高、成像速度快、图像信噪比高、光谱图像自动配准等诸多优势,但由于缺乏适配的光源没能得到广泛的应用。本文利用时分复用和三通道时间透镜光源实现了同步多色CARS显微成像。文中首先对PMMA和PS混合微球进行了多色CARS显微成像实验,区分了二者的空间分布,实验中非共振背景抑制将PMMA图像4.5:1和PS图像4:1的对比度分别提升至60:1和40:1;随后对小鼠耳部进行了显微成像实验,实现了对CH2和CH3拉伸振动的同步探测,同步实现的非共振背景抑制将脂质丰富区CH2图像4:1和CH3图像3:1的对比度分别提升至50:1和30:1;最后利用原位校正方法将脂质与蛋白质这两种纯物质的图像进行了有效分离,使CARS显微成像具备了与SRS显微成像相比拟的化学特异性。