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[研究目的]1.临床研究在中医辨证理论指导下,研究非小细胞肺癌(non-small cell Lung cancer,NSCLC)合并恶性胸腔积液(Malignant Pleural Effusion,MPE)局部辨证为“寒湿毒证”和“湿热毒证”两种中医证型患者临床理化指标、治疗模式及生存期的差异,为NSCLC合并MPE患者的中医辨证提供客观依据,并探讨中医证型与患者预后的相关性。2.实验研究研究“寒湿毒证”和“湿热毒证”患者胸腔积液中miRNA表达谱的差异,对筛选出的差异表达的miRNA分子行靶基因预测,进一步对预测的靶基因行KEGG Pathway生物通路分析及GO基因功能富集分析,找出靶基因的富集功能及其调控的信号通路,发现用于辅助诊断的生物标记物,为中医辨证提供分子生物学方面的客观依据。[研究方法]1.临床研究采用回顾性研究的方法,收集2013年6月1日-2019年11月30日就诊于北京中医药大学东方医院符合纳入标准的NSCLC合并MPE的患者资料。比较“寒湿毒证”组和“湿热毒证”患者一般资料、胸水引流时临床理化指标(包括血常规、血生化、凝血功能、血清肿瘤标记物、胸水常规、胸水生化、胸水肿瘤标记物)检测结果、胸水引流后采用的治疗方案(包括中西医结合治疗、中医治疗、西医治疗、维持治疗)、生存期(平均生存期、1、6、12、24个月生存率)差异。2.实验研究收集2019年1月1日-2019年11月30日就诊于北京中医药大学东方医院的NSCLC合并MPE的患者初次行闭式胸腔引流术时的胸水标本,根据纳入标准分为湿热毒证组和寒湿毒证组,每组各4例。提取胸水中miRNA,采用高通量测序方法测定两组胸水中miRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNA分子并进行靶基因预测,进一步对预测的靶基因进行GO基因功能富集分析和KEGG Pathway生物通路分析。[研究结果]1.临床研究(1)一般资料及肿瘤相关信息共纳入241例病例,湿热毒证组为90(37.34%)例,寒湿毒证组为151(62.66%)例,占比高于湿热毒证。两组患者在年龄、性别、吸烟史、肿瘤家族史、KPS评分方面无统计学差异(P>0.05)。肿瘤相关信息方面,两组均为右肺、肺腺癌、低分化、肺和淋巴转移占比最高。两组共有101例患者进行了基因检测,湿热毒证组19外显子突变占比高,寒湿毒证组21外显子突变占比高,两组基因突变位点比较无统计学差异(P>0.05)(2)理化指标1)血常规:两组患者RBC和HGB值均低于标准值,MONO值高于标准值。湿热毒证组WBC、LYM、PLT、MONO值高于寒湿毒证组,HGB值低于寒湿毒证组,差异无统计学意义(P>0.05)。2)血生化:两组患者TP、ALB和A/G值均低于标准值。湿热毒证组ALT、AST、ALP、LDH高于寒湿毒证组,IBIL、ADA、GLU值低于寒湿毒证组。两组ALT、AST值具有统计学差异(P<0.05)。3)凝血功能:两组患者FIB和D-d值均高于标准值。湿热毒证组FIB、D-d值高于寒湿毒证组,差异无统计学意义(P>0.05)。4)血肿瘤标记物:两组患者CEA和Cyfra21-1值均高于标准值。两组患者比较,湿热毒证组CEA、Cyfra21-1值高于寒湿毒证组,差异无统计学意义(P>0.05)。5)胸水指标(常规、生化、肿瘤标记物):湿热毒证组细胞总数、RBC、WBC、蛋白、ADA、LDH、NSE、Cyfra21-1值高于寒湿毒证组;GLU、CEA值低于寒湿毒证组;两组细胞总数、RBC、WBC、GLU、蛋白、ADA、LDH、NSE、Cyfra21-1差异有统计学意义(P<0.05)。(3)治疗方案湿热毒证组和寒湿毒证组均为中西医结合治疗方案占比最高,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。湿热毒证采用胸腔灌注中药注射液的患者占比高于寒湿毒证组,差异有统计学意义(P<0.05)(4)生存期湿热毒证组平均生存期为7.76个月;寒湿毒证组平均生存期为9.24个月。两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。湿热毒证组的1、6、12、24个月生存率分别为73.33%、38.89%、13.33%、3.33%;寒湿毒证组的1、6、12、24个月生存率分别为80.13%、41.72%、20.53%、2.65%。未予中药注射液胸腔灌注治疗的两组患者平均生存期结果分别是,湿热毒证组平均生存期6.14个月;寒湿毒证组平均生存期9.38个月。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.实验研究(1)两组miRNA表达差异分析两种证型间差异表达miRNA共有100个,其中湿热毒证组较寒湿度毒整组上调表达的miRNA有56个,主要与miR-200家族等有关;下调表达的miRNA有44个。(2)两组差异表达miRNA靶基因GO富集分析对湿热毒证组较寒湿毒证组上调表达miRNA靶基因进行GO富集分析,结果显示主要涉及血管生成、细胞发育、mRNA代谢过程、信号转导蛋白磷酸化、离子跨膜转运的调节、细胞外结构、血管形态发生等过程;下调表达miRNA靶基因进行GO富集分析,结果显示涉及生物学过程有细胞发育的负调控、信号转导蛋白磷酸化、T细胞活化的调节、细胞外结构、离子跨膜运输、白细胞分化、细胞蛋白定位的正向调控、有丝分裂细胞周期的负调控等。(3)两组差异表达miRNA靶基因KEGG富集分析湿热毒证较寒湿毒证上调靶基因KEGG富集结果与染色体及相关蛋白、蛋白聚糖、磷脂酶D信号通路、cAMP信号通路、血小板激活等相关;下调靶基因KEGG富集结果与蛋白聚糖、磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号系统、鞘脂类信号通路、磷脂酶D信号通路、cAMP信号通路、自噬等相关。[研究结论]1.临床研究本研究发现,NSCLC合并MPE的患者中医局部辨证分型以“寒湿毒证”多见,病理类型以肺腺癌为主。两种证型的差异与性别、年龄、病理类型、肿瘤家族史、吸烟史、KPS评分、基因突变类型无明显相关性。理化指标、治疗方式、生存期的研究结果提示,胸水指标中细胞总数、RBC、WBC、GLU、蛋白、ADA、LDH、NSE、Cyfra21-1值与NSCLC合并MPE患者局部辨证分型有一定相关性,可作为局部辨证分型客观依据,湿热毒证组较寒湿毒证组预后差。中西医结合治疗有利于提高生存期,采用中医局部辨证、中药局部灌注治疗也使患者受益,值得今后在临床进一步推广。2.实验研究湿热毒证较寒湿毒证在基因层面存在miRNA表达水平的差异,其中上调表达的miRNA大多与患者的预后不良有关,下调表达的miRNA主要与抑制肿瘤的进展和耐药发生相关。GO分析结果提示,两组差异表达miRNA涉及的生物学过程主要包括血管形成、T细胞活化的调节、白细胞分化等作用。KEGG分析结果提示,两组差异表达miRNA涉及的KEGG信号通路主要与PI3K-Akt相关。