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本课题分三部分,第一部分从临床角度阐述单纯性颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)患者血浆凝血因子VII活性(coagulation factor VII activity,CFVIIa)水平与颅内进展性出血性损伤(progressive hemorrhagic injury,PHI)的相关性;第二和第三部分分别从细胞和临床角度研究凝血因子VII(coagulation factor VII,CFVII)启动子区甲基化对CFVII基因表达调控作用及与PHI的相关性。各部分研究摘要如下:第一部分单纯性颅脑创伤患者血浆凝血因子VII活性水平与颅内进展性出血性损伤的相关性目的:研究单纯性TBI患者血浆CFVIIa水平与PHI的相关性。方法:根据研究纳入和排除标准选取2010年8月至2014年6月在上海华山医院神经创伤中心急诊入院的年龄≥17岁的中重度单纯性TBI患者112例,采集患者入院时外周静脉血标本并送检国际标准化比值(international normalized ratio,INR)、活化部分凝血活酶时间(activeated partial thromboplasting time,APTT)、血小板(platelet,PLT)、D-二聚体、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及CFVIIa。每24 h随访患者头颅CT一次,当再次CT扫描较首次CT扫描显示的出血性病灶扩大或有新出现的出血性病灶时被诊断为PHI。结果:PHI组患者血浆CFVIIa及PLT水平均显著低于非PHI组(77.79%±22.82%VS 100.32%±30.39%;126.95±48.46 VS 148.13±53.41;P<0.05);PHI组患者血浆APTT、INR、D-二聚体、FIB均高于非PHI组,但两组之间差异不明显(P>0.05)。Logistic回归分析,结果显示血浆CFVIIa低下(OR=1.06,95%CI=1.03~1.10,P<0.001)及PLT水平降低(OR=1.01,95%CI=1.00~1.02,P=0.009)是单纯性TBI患者发生PHI的独立危险因素。结论:单纯性TBI后PHI患者血浆CFVIIa及PLT水平均显著低于非PHI患者,血浆CFVIIa低下及PLT水平降低是单纯性TBI患者发生PHI的独立危险因素。第二部分凝血因子VII启动子区甲基化调控凝血因子VII表达目的:研究CFVII基因启动子区甲基化对CFVII表达调控作用。方法:基因合成CFVII启动子区-781--1bp及-1000--1 bp两条片段,并将上述片段亚克隆至PGL3-basic载体,获得重组质粒PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7UM-1000--1。酶切、测序验证无误后,用甲基化转移酶(M.Sss I,NEB)对重组质粒、PGL3-Basic、PGL3-Control质粒进行全甲基化修饰得到甲基化质粒。本实验共分9组,分别为无转染对照、PGL3-Basic(UM)、PGL3-Basic(M)、PGL3-Control(UM)、PGL3-Control(M)、PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7M-781--1、PGL3-F7UM-1000--1、PGL3-F7M-1000--1。利用脂质体转染试剂分别将以上质粒及对照质粒PRL-TK转染入人肝癌细胞(Hep G2),检测荧光素酶活性。结果:各组甲基化质粒较未甲基化质粒荧光素酶表达水平均显著降低(P<0.001)。其中PGL3-F7M-781--1组荧光素酶表达较PGL3-F7UM-781--1组下降了约110倍(P<0.001);而PGL3-F7M-1000--1组较PGL3-F7UM-1000--1组荧光素酶表达下降约244倍(P<0.001)。两组非甲基化重组质粒荧光素酶表达水平无明显差异(P=0.28);而两组甲基化重组质粒荧光素酶表达水平差异有统计学意义(P<0.001)。结论:CFVII启动子区甲基化影响CFVII基因表达,启动子区高甲基化将导致CFVII基因表达降低。位于启动子区-781 bp至-1000 bp之间的Cp G甲基化对CFVII基因表达影响更显著。第三部分单纯性颅脑创伤患者血浆凝血因子VII启动子区甲基化与凝血因子VII活性水平及颅内进展性出血性损伤相关性研究目的:研究单纯性TBI患者血浆CFVII启动子区甲基化水平与血浆CFVIIa水平之间关系,并探讨CFVII启动子区甲基化与PHI的相关性。方法:选取符合条件的中重度单纯性TBI患者79例,采集患者入院时外周静脉血,并送检CFVIIa、PLT、APTT、INR、FIB、D-二聚体。提取患者血液基因组DNA,并对其进行亚硫酸氢盐处理,设计合成引物,PCR扩增目的基因片段,采用Sequenom质谱法检测患者CFVII启动子区甲基化水平。本实验共采用两种分组方法:CFVIIa≥90%组与CFVIIa<90%组,PHI组与非PHI组。PHI定义与前述相同。结果:采用独立样本T检验对所研究的FVII启动子区Cp G位点进行比较发现:CFVIIa≥90%组与CFVIIa<90%组患者Cp G3位点甲基化率有显著性差异(0.83±0.05VS 0.85±0.03,P<0.05),CFVIIa≥90%组患者Cp G3位点甲基化率小于CFVIIa<90%组;而两组患者Cp G2、Cp G4、Cp G5、Cp G6等位点甲基化率无显著性差异(P>0.05);PHI组与非PHI组患者以上各Cp G位点甲基化率均无显著性差异(P>0.05)。结论:单纯性TBI患者CFVII基因启动子区甲基化与患者血浆CFVIIa水平相关,甲基化率高,患者血浆CFVIIa水平低;而CFVII启动子区甲基化率与患者是否发生PHI无关。