【摘 要】
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本文基于核酶(DNAzyme)和链置换等温扩增技术(SDA)建立了一种检测RNA的新方法,该方法在等温的条件下进行,能够迅速、简便的实现RNA的扩增和高灵敏专一地定性和定量的检测RNA。
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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本文基于核酶(DNAzyme)和链置换等温扩增技术(SDA)建立了一种检测RNA的新方法,该方法在等温的条件下进行,能够迅速、简便的实现RNA的扩增和高灵敏专一地定性和定量的检测RNA。并且,该方法不易被基因组DNA所污染,同时适用于mRNA和miRNA的检测。主要内容包括:
1.改良10-23DNAzyme,使被剪切后RNA的末端碱基与DNAzyme完全互补配对。RNA被剪切后的末端是2,3-环状磷酸苷,可用T4多聚核苷酸激酶(PNK)水解,实现以被剪切的RNA为引物的链置换等温扩增方法。
2.链置换等温扩增方法,不需要周期性的上下调节温度,从而可以采用简便的装置实现扩增,使得操作进一步简便化,迅速化。
3.该方法具有很高的灵敏度和专一性。由于将三个链置换等温扩增结合在一起,能够在短时间内实现扩增,使该方法具有很高的灵敏度,其中定性检测限达1fmol,定量检测限达69.2aM。该方法的专一性取决于剪切RNA的DNAzyme。
4.报告方式多样化。根据不同G-四聚体的性质,设计了两种不同的探针,一种是用于定性检测的探针,产生的是具有过氧化酶活性的DNAzyme,当结合氯高铁血红素时能够催化H2O2氧化2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑琳-6-磺酸)(ABTS2-)发生显色反应呈现绿色。一种是用于定量检测的探针,产生的G-四聚体可以结合孔雀石绿产生荧光。将孔雀石绿和G-四聚体开发作为报告基团应用到实时荧光检测中,降低了实时检测的成本,使操作非常简便,实现非常高的灵敏度。
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