背景与目的β地中海贫血(简称β地贫)是世界上最常见的常染色体单基因隐性遗传病之一。β地贫在全球许多地区具有很高的发生率，目前公认的原因是由于疟疾选择的结果。因此地贫主要分布在疟疾高发的热带亚热带地区，从地中海沿岸和非洲大部分地区到中东、印度次大陆、中国南方、东南亚、并延伸至印度尼西亚和太平洋地区，而美国、中美和南美等国因移民原因也成为高发地区。β地贫是我国长江以南各省区高发的血液遗传病，广东、广西、海南、江西、台湾和香港等地尤为突出，受累人口多达2亿以上。β地贫是由于β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链缺如(β°)或合成不足(β~+)而引起的遗传性溶血性贫血病。β地贫的分子病理具有高度的异质性，主要为11号染色体上β-珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。目前全世界已报道的基因突变类型达200多种，不同种族人群有其自身的常见突变类型。重型β地贫是致死性疾病，患者必需通过定期输血和去铁治疗来维持生命，因此，β地贫仍是这些高发地区最关心和最棘手的公共健康问题之一。对于一个地贫高发的地区或国家而言，控制该病的最有效途径是在遗传流行病学研究的基础上制订预防计划，通过实施大人群的筛查和高风险夫妇的产前诊断来防止重症患儿的出生。β地贫的基因诊断和产前诊断先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)连锁分析、寡核苷酸探针杂交(Allele Specific Oligonucleotide，ASO)和基因芯片(Gene Chip)等技术。目前，用于诊断β地贫的分子生物学方法主要为经典的反向点杂交(Reverse Dot Blot，RDB)技术。但上述方法存在操作烦琐，对引物标记、探针合成及标记技术要求较高，诊断速度慢，不适合进行大人群筛查，容易出现假阳性和假阴性结果并进一步导致误诊或者漏诊等缺点。高效液相色谱技术(Denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)已被证明是一种精确、高效、经济、高通量自动化的检测已知点突变及筛查未知突变的方法。其敏感性和特异性可达96％～100％，明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术，目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F-SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美。另外，若同时选多个温度条件进行分析还能进一步增加DHPLC的变异检出率。本研究的目的是基于DHPLC上述特点，建立一种快速、高灵敏度、准确、经济、高通量自动化的β地贫诊断方法，用于已知β地贫点突变的快速基因诊断和产前诊断以及发现新的突变位点或单核苷酸多态性位点(Single NucleotidePolymorphisms，SNPs)。设计与方法针对中国人群β地贫已知35种突变类型及其在β珠蛋白基因中的位置，设计三对涵盖所有突变热点区的特异性聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物，通过条件优化实现在同一条件下的常规PCR扩增。PCR产物在DHPLC半变性条件下，对同源双链或异源双链进行分析，不同基因型表现为洗脱峰峰型的差异和／或保留时间长短的差异。795例基因组DNA样品作为本方法学建立的基础，其中包括407例经RDB确诊的患者基因组DNA样品和388例正常人基因组DNA样品。随机抽取其中的319例基因组DNA样品进行测序分析，作为盲法对照实验，用于评价本方法的准确性。这319例DNA样品包括258例β地贫点突变或点突变复合多态性位点的DNA样品和61例正常DNA样品。此外，经DHPLC分析获得的与已知突变峰型不同的样品，通过DNA测序以期发现新突变或SNP位点。本方法建立及评价完成后，将其用于β地贫的临床产前诊断，并与RDB诊断方法的结果进行比对，得出本方法的实用性。结果与讨论本研究共检测分析了795例DNA样品，这些样品中包含了20种不同β珠蛋白基因突变类型和8个多态性位点。通过DHPLC方法检测分析，得到了68种不同的特异性洗脱峰标准图谱。在盲法对照实验中，得到了与DHPLC检测方法完全一致的分析结果。同时在实验过程中，我们还检测到了4例用常规分析手段未检测出的新突变，这4例新突变均为首次报道。此外还发现一例-98突变，但其是否对β地贫构成贡献有待进一步研究。应用DHPLC对9例中国家系进行产前诊断的结果与RDB方法诊断结果完全一致。本研究建立的基于DHPLC的β地贫已知突变基因诊断技术是一种高通量、高灵敏度、自动化、快速、准确、经济的点突变检测技术。该方法用于诊断β地贫，消除了目前广泛应用的RDB检测方法存在的假阳性及假阴性问题，并能用于β地贫未知突变的检出。鉴于对本技术方法的双盲评价结果，该技术完全可应用于临床遗传学实验诊断，并将对β地贫的基因诊断和产前诊断以及防止重症患儿出生做出重要贡献。