核糖体的正确组装是蛋白质合成和细胞存活的重要保证。真核生物核糖体的组装过程起始于核糖体前体RNA(pre-rRNA)在核仁中的转录。Pre-rRNA需要经过多步复杂的核酸酶切过程才能形成成熟的核糖体RNA(rRNA)。在酿酒酵母中,有200多个蛋白组装因子和76个小核仁RNA(snoRNA)参与了核糖体的组装过程。不同的组装因子在特定阶段与pre-rRNA结合,形成一系列核糖体前体颗粒。90S核糖体前体是核糖体小亚基组装过程中最早形成的前体,是由70多个蛋白组装因子,U3、U14、snR10和snR30等snoRNA以及若干核糖体蛋白结合pre-rRNA的5’区域逐步形成的。Pre-rRNA在AO,A1和A2位点被剪切后,90S核糖体前体转变成了 pre-40S前体,pre-40S最终在细胞质中形成成熟的核糖体小亚基。本研究应用结构生物学、酵母遗传学和生物化学等研究方法系统地研究了核糖体组装因子Utp24和Mtr4的结构和功能。Utp24是90S颗粒上含有PIN结构域的核酸内切酶,被认为是负责剪切pre-rRNA的A1和A2位点的酶。本研究解析了分辨率为2.1 A的裂殖酵母Utp24的晶体结构。该结构只含有Utp24的PIN结构域,缺少N端序列。Utp24和另一个核糖体组装因子 Utp23在结构上很相似,二者的PIN结构域都含有一个CCHC类型的锌指基序。为了分析Utp24的功能,在酿酒酵母中首先抑制Utp24野生型蛋白的表达,然后表达突变体蛋白。突变结合锌离子的氨基酸残基抑制了酵母的生长和18S rRNA的形成,这表明锌指基序是Utp24重要的功能元件。缺失Utp24阻碍了pre-rRNA在A0,A1和A2位点的剪切并且影响了 90S的组装。组装了 Utp24内切酶活性突变体蛋白的90S颗粒积累了大量的22S pre-rRNA,并且.富集了降解5’ ETS的外切体,这表明Utp24活性突变后90S被阻滞在了 A0剪切后的状态。此外,大部分22S pre-rRNA的3’端被多聚腺苷酸化,这表明22S pre-rRNA受到TRAMP介导的RNA质量控制系统的监控。尽管Utp24在不同物种间高度保守,人源和裂殖酵母的Utp24能组装到酿酒酵母90S,但不能形成有活性的90S,这显示Utp24需要精确组装到90S才能发挥功能。本研究从结构和生化角度揭示了 Utp24对90S组装和活性的重要性。本研究分析了 RNA解旋酶Mtr4在核糖体小亚基组装过程中的功能。将MTR4基因的启动子用GAL启动子替换后在含葡萄糖培养基中抑制其表达,当Mtr4蛋白耗尽后分析90S中的RNA和蛋白组分。Mtr4缺失后导致90S中22S pre-rRNA大量积累,同时阻断核外切体和90S的结合,而核外切体和90S的结合是5’ETS降解所必需的。Mtr4的缺失也导致90S无法向pre-40S转变。Mtr4酶活性对酵母生长和小亚丛组装也是必需的。本研究解析了来源于Mtr4缺失的酵母细胞的90S冷冻电镜结构,该结构的平均分辨率为4.5 A。本研究表明Mtr4是90S招募外切体和核糖体小亚基形成所必需的。本研究对核糖体组装因子Utp24和Mtr4在90S组装过程中的功能进行了深入研究。通过对这两个因子各种突变体的研究,加深了对90S组装过程的认识。异常积累的pre-rRNA的3’端出现多聚腺苷酸,研究这些多聚腺苷酸的生成机制以及生物学意义也是本研究提出的新的科学问题。