研究背景恶性肿瘤的治疗首选手术切除,而术后肿瘤复发是影响手术治疗效果的主要问题,也是临床医师普遍面对的具有挑战性的难题。尽管过去几十年,肿瘤术后复发生长已得到临床医师的极度重视,相关肿瘤复发机制的研究有明显的进步,但是关于肿瘤术后复发的影响的许多疑问,有待于进一步解决。因此,本研究通过动物模型实验来研究创伤应激对肿瘤生长的影响,具有极为重要的意义。Reiche等认为应激与肿瘤发展具有显著的相关性。应激主要是通过调控宿主机体的神经内分泌免疫网络,干扰免疫系统的功能发挥作用。应激状态下,机体生物节律紊乱也发挥了重要作用：表现为内分泌紊乱(糖皮质激素、泌乳素、TSH/GH/LH/FSH等)机体代谢紊乱(体温变化、蛋白质和酶的代谢)、免疫功能紊乱,最终诱导和加速肿瘤的发展及肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视。同时,应激也通过机体神经内分泌系统引起机体交感神经系统兴奋,释放儿茶酚胺,直接抑制细胞(NK细胞)免疫功能及促使TH细胞分泌的细胞因子(IL-1、TNF-α)间接抑制细胞免疫功能,从而促进肿瘤细胞生长。Kwan等通过门静脉右支注入肿瘤细胞,建立右肝转移瘤模型；肝左叶施予缺血再灌注损伤或PHx等研究因素,观察右肝移植瘤的生长及转移情况。此研究证实了肝脏局部创伤应激能够促进肝肿瘤生长、转移,而对于创伤引起的全身应激反应对肿瘤生长转移的影响未予研究。因此,我们通过烫伤所引起的全身应激反应来观察其对肿瘤生长的影响作用。研究创伤应激对肿瘤的影响,是否与机体免疫功能紊乱有关,需用非免疫缺陷的动物来建立肿瘤模型。Wistar大鼠属于封闭群动物,其遗传异质性与人类近似,免疫功能较为完善。Walker-256细胞肿瘤是1928年Walker从大鼠自然生成的乳腺癌细胞株中筛选出来的肿瘤细胞株,是肿瘤侵袭与转移的常用瘤株,具有肉瘤特性,膨胀性生长。研究发现,带瘤鼠存活时间相对较长,可以满足几乎所以的相关实验过程中对于大鼠的存活时间要求,其皮下种植瘤生长速度较快,消退率低,且便于观察肿瘤生长情况,因此,我们可以用Walker-256细胞种植于Wistar大鼠皮下制成皮下种植瘤模型。研究创伤应激对大鼠皮下移植瘤生长的影响作用,特别是不同程度的创伤应激对大鼠移植瘤的生长作用,为临床术后肿瘤复发生长提供科学的实验理论依据和安全有效地实验方法,为研究创伤应激与肿瘤的关系提供了新角度。研究目的本研究的目的通过建立Wistar大鼠皮下移植瘤模型,对模型大鼠进行不同程度的烫伤,探讨不同程度的创伤应激反应对大鼠皮下移植瘤生长的影响,明确创伤后全身应激反应对肿瘤生长的影响。材料与方法1、材料：Wistar大鼠30只、Wistar幼鼠2只,(?),购自北京军事医学科学院实验动物中心；Wistar大鼠体质量(120±20)g,用于制作皮下移植瘤模型；Wistar幼鼠,断乳2周,用于制作腹水瘤以传代保种；Walker-256细胞株由解放军总医院提供。2、幼鼠腹水瘤模型制作取出-80℃液氮冻存Walker-256细胞株的冻存管1只,立即投入37℃水浴中,待其完全融化后,取出冻存管,吹打细胞,将细胞悬液移入15ml离心管中。轻轻摇晃离心管,缓慢加入PBS至5ml,其过程持续约2min。1500r/min离心5min,弃上清,PBS洗2次。用2mlPBS重悬细胞,安尔碘消毒种鼠右下腹皮肤,用1ml无菌注射器抽取1ml细胞悬液,注入2只Wistar幼鼠腹腔内,每只lml,5天后Wistar幼鼠出现腹水体征。3、大鼠皮下移植瘤模型制作用10ml无菌注射器抽取腹胀明显的Wistar幼鼠,抽取米黄色癌性腹水30ml,以1500r/min离心5min,PBS洗涤3次,浓缩细胞浓度约2×108/m1；将Wistar大鼠左侧腹股沟处皮肤常规消毒,皮下注射腹水瘤细胞,每个注射点注射0.3ml。5d后局部可触及直径约0.3cm的瘤结节。皮下移植瘤模型制备成功。4、动物分组及处理：接种10天后,选取24只Wistar大鼠入组(肿瘤>0.5cm或<0.2cm均不入选),采用随机数字表法,将24只大鼠随机分为实验对照组、轻度烫伤组、重度烫伤组,每组8只。大鼠背部用婴儿电动剃毛刀剃毛,氯胺酮与脉安定1：1混合,按lml/kg进行腹腔注射麻醉。根据Rubner公式计算大鼠体表面积S(m2)=0.0913×体重(kg)2/3,烫伤面积=S×拟烫伤面积百分比(%),在木板上刻出不同面积的长方形洞,用于烫伤动物模型的制备。实验对照组：不做任何处理；轻度烫伤组：大鼠固定于木板,背部凸出皮肤浸入100℃水中5s,烫伤面积约10%；重度烫伤组：大鼠固定于木板,背部凸出皮肤浸入100℃水中10s,烫伤面积约15%。烫伤后动物立即予以干纱布拭干背部,涂碘伏抗感染,根据烫伤程度分别予以腹腔注射生理盐水补液治疗。5、指标检测分别于不同时间采用ELISA法测定血清皮质醇及血清IL-1β、TNF-α含量；大鼠处死后,取肿瘤组织行光镜病理学观察。6、统计方法数据用SPSS13.0统计软件进行分析,统计学处理实验数据用x±s表示,统计推断采用重复测量因素的方差分析,组间比较采用LSD(方差齐时)或Dunnett T3(方差不齐时)法,以P<0.05表示有显著差异。结果1、大鼠一般情况各组皮下肿瘤随着时间的延长而增大,无自发消退现象。随着肿瘤的增大,大鼠逐渐表现为形体明显消瘦,体重下降,活动弛缓,反应迟钝,被毛无光泽,肿瘤越大,活动弛缓等表现越突出。重度烫伤组大鼠肿瘤较大,状态较差,被毛稀疏粗乱;对照组大鼠状态好于烫伤组,但各组之间比较差异以重伤组为显著。剥落瘤块肉眼可见实验对照组的体积较小,形状比较规则。2、血清皮质醇浓度测定烫伤后大鼠血清皮质醇水平与烫伤程度存在交互作用(F=6.754,P=0.001)；烫伤后同一组不同时间大鼠血清皮质醇水平之间有显著差异,轻伤组和重伤组F值分别为3.921、8.383,各组均<0.05。在同一时间点,各组之间也有显著性差异,三组在不同的时间点的F值分别为30.824、39.164、9.527,各组均<0.001；从时间看,烫伤1天后各组之间均有显著差异,大鼠血清皮质醇在烫伤1天后开始上升,7天后达到高峰,13天后逐渐下降；烫伤1天后对照组(59.08±9.89ug/L)与轻伤组(84.58±11.46ug/L)血清皮质醇浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清皮质醇浓度(110.84±17.10ug/L)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后7天后对照组(60.72±11.28ug/L)与轻伤组(98.54±14.37ug/L)血清皮质醇浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清皮质醇浓度(137.19±27.71ug/L)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后13天,对照组(60.84±11.88ug/L)与轻伤组(80.39±14.64ug/L)血清皮质醇浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组(95.63±20.27ug/L)血清皮质醇浓度明显大于对照组(P<0.05)有统计学差异；3、血清白介素-1β浓度测定烫伤后大鼠血清IL1-β水平与烫伤程度存在交互作用(F=251.880,P=0.000)；烫伤后同一组不同时间大鼠血清IL1-β水平之间有显著差异,轻伤组和重伤组F值分别为140.525、149.139,各组均<0.001。在同一时间点,各组之间也有显著性差异,三组在不同的时间点的F值分别为320.653、391.699、85.034,各组均<0.001；从时间看,烫伤1天后各组之间均有显著差异,大鼠血清IL1-β在烫伤1天后开始上升,7天后达到高峰,13天后逐渐下降；烫伤1天后对照组(5.69±1.73pg/ml)与轻伤组(94.03±11.01pg/m1)血清白介素-1β浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清白介素-1β浓度(150.41±16.56pg/ml)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后7天对照组(5.7±1.7pg/ml)与轻伤组(135.05±14.53pg/ml)血清白介素-1β浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清白介素-1β浓度(196.08±19.1pg/ml)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后13天.对照组(5.60±1.75pg/ml)与轻伤组(37.60±8.75pg/ml)血清白介素-1β(P<0.05)有统计学差异,重伤组(60.06±11.49pg/ml)血清白介素-1β明显大于对照组和轻伤组(P<0.05)有统计学差异；4、血清肿瘤坏死因子-a浓度测定烫伤后大鼠血清TNFα水平与烫伤程度存在交互作用(F=76.947,P=0.000)；烫伤后同一组不同时间大鼠血清TNF-α水平之间有显著差异,轻伤组和重伤组F值分别为21.915、83.204,各组均<0.001。在同一时间点,各组之间也有显著性差异,三组在不同的时间点的F值分别为442.642、234.768、40.691,各组均<0.001；从时间看,烫伤1天后各组之间均有显著差异,大鼠血清TNF-α在烫伤1天后开始上升,7天后达到高峰,13天后逐渐下降；烫伤1天后对照组(6.68±1.64ng/ml)与轻伤组(43.76±6.52ng/ml)血清肿瘤坏死因子-α浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清肿瘤坏死因子-α浓度(126.55±12.61ng/ml)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后7天对照组(6.62±1.58ng/ml)与轻伤组(65.01±13.37ng/ml)血清肿瘤坏死因子-α浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组血清白介素-1β浓度(157.04±20.17ng/ml)(P<0.05)明显高于对照组和轻伤组；烫伤后13天,对照组(6.65±1.57ng/ml)与轻伤组(30.2±10.77ng/ml)血清肿瘤坏死因子-α浓度(P<0.05)有统计学差异,重伤组(54.98±15.04ng/ml)血清肿瘤坏死因子-α浓度明显大于对照组和轻伤组(P<O.05)有统计学差异;5、大鼠皮下肿瘤体积测定烫伤后大鼠肿瘤体积水平与烫伤程度存在交互作用(F=11.312,P=0.000)；烫伤后同一组不同时间大鼠肿瘤体积生长水平之间有显著差异,轻伤组和重伤组F值分别为20.575、16.775,各组均<0.05。在同一时间点,各组之间也有显著性差异,三组在不同的时间点的F值分别为1.124、10.528、11.883,各组均<0.001(除烫伤1天P=0.344)；从时间看,各组之间均有显著差异,随着时间的延长,各组大鼠肿瘤体积明显增大；烫伤后1天,各组间肿瘤体积(P>0.05)无统计学差异；烫伤后7天,对照组(0.312±0.098cm3)与轻伤组(0.448±0.186cm3)肿瘤体积(P>0.05)无统计学差异,重伤组肿瘤体积(1.143±0.639cm3)(P<0.05)明显大于对照组和轻伤组；烫伤后13天,对照组(0.593±0.195cm3)与轻伤组(0.782±0.344cm3)肿瘤体积(P>0.05)无统计学差异,重伤组(1.806±0.838cm3)肿瘤体积明显大于对照组和轻伤组(P<0.05)有统计学差异；6、病理检查：肿瘤细胞形态多样,病理性核分裂易见。HE染色结果说明皮下移植瘤大鼠模型建立成功。在光镜下可见烫伤组肿瘤细胞密度均较对照组大;各组均有纤维组织增生和炎细胞浸润,尤重度烫伤组为甚。结论1、本实验研究证明烫伤后大鼠血清皮质醇水平与烫伤程度存在交互作用；大鼠烫伤程度越重,大鼠机体释放的皮质醇浓度越大,大鼠应激性反应越强：应激反应的程度与烫伤程度呈正相关。2、本实验研究证明烫伤后大鼠血清白介素-1β水平与烫伤程度存在交互作用；大鼠烫伤程度越重,大鼠机体释放的血清白介素-1β浓度越大,血清白介素-1β浓度与烫伤程度呈正相关。3、本实验研究证明烫伤后大鼠血清肿瘤坏死因子-α浓度与烫伤程度存在交互作用；大鼠烫伤程度越重,大鼠机体释放的血清肿瘤坏死因子-α浓度越大,血清肿瘤坏死因子-α浓度与烫伤程度呈正相关。4、本实验研究证明烫伤后大鼠皮下肿瘤的体积生长速度与烫伤程度存在交互作用；大鼠烫伤程度越重,大鼠皮下肿瘤的体积生长速度越快,大鼠皮下肿瘤的体积生长速度烫伤程度呈正相关。5、烫伤后大鼠体内皮质醇及炎症介质的释放明显增多,大鼠皮下移植瘤的生长明显加快；因此,烫伤应激后后大鼠应激反应程度越强,大鼠体内炎症介质释放越多,大鼠皮下肿瘤的生长越快,重度烫伤后应激反应能够促进Wistar大鼠皮下移植瘤的生长。