目的： 高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是哺乳动物细胞中广泛表达的核蛋白，该蛋白由215个氨基酸残基组成，其N-端包含2个结构域：HMGB1-boxA和HMGB1-boxB，均由约80个氨基酸残基构成，呈较强的碱性，为与DNA非特异结合区[1]。 HMGB1释放至胞外后，B盒是引起炎症反应的功能域，而A盒对B盒有一定的拮抗作用；核外HMGB1与DNA非特异性结合，亲和力低，在细胞核内参与细胞分化、DNA修复、DNA重组及类固醇激素调控等生命活动。尽管HMGB1蛋白缺少引导肽，且不能穿出内质网和高尔基细胞器，但仍可通过活化细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放进入胞外。在胞外，HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子，与脓毒症、关节炎、急性肺炎、肝炎、自身免疫性疾病等的发病机理关系密切。 胞外HMGB1需与相应胞膜受体结合才能发挥其生物学效应。晚期糖基化终末产物受体（RAGE）与HMGB1具有高亲和力，是HMGB1的主要受体。HMGB1与RAGE结合后，可引发MAPK的磷酸化、核转录因子NF-κB和活化蛋白-1的核内转移，使许多其它炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表达加强和释放增多而启动炎症或使炎症恶化[3]。现已发现脓毒血症患者的HMGB1水平显著增高，且患者的HMGB1水平越高，其死亡的可能性越大。另外，HMGB1还是多种自身免疫性疾病的重要免疫原。HMGB1在炎症中的核心地位表明HMGB1很可能成为疾病治疗的有效靶点分子。 现有研究表明，在胞外，HMGB1的致炎作用主要是由其boxB结构域来行使，并且单独boxB即可发挥致炎作用。与此相反，单独boxA则具有显著抑制HMGB1及其boxB致炎作用的能力，现已成为HMGB1有效的拮抗剂。现已研发了多种在动物实验中有明显效果的HMGB1拮抗剂，但临床效果有待研究。HMGB1从细胞中释放的调节机制、HMGB1的信号转导机制还需要深入研究和阐明。本课题以此为思路，将HMGB1-boxA的基因克隆并在大肠杆菌表达，从而得到纯化的重组蛋白，为进一步研究其生物学活性打下基础。 方法和结果： 1.成熟人HMGB1-BOXA的基因克隆及序列分析 取正常人新鲜外周血，提取单个核细胞，用本室制备的RNA提取试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA为模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶的作用下进行反应，合成cDNA的第一链。根据HMGB1-boxA的编码序列，设计扩增成熟人HMGB1-boxA基因的一对引物，分别在上下游引物5端加上限制性酶切位点EcolRⅠ初BglⅡ。设计上游引物时，在成熟人HMGB1-boxA编码序列的上游加上起始密码子ATG，同时在上游加上保护性碱基GC，下游引物加上TA，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。以RT反应产物cDNA为模板，用Tαg DNA聚合酶进行PCR扩增HMGB1-boxA基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，接种于含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，采用ABI3100-Avant Genetic Analyzer全自动DNA测序仪测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人HMGB1-boxA基因完全一致。成功构建了人HMGB1-boxA的重组质粒pMD18-T/HMGB1-boxA。 2.人/HMGB1-BOXA基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切消化重组质粒pMD18-T/HMGB1-boxA，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化HMGB1-boxA片断，插入原核表达载体pBV220的PL启动子的下游，构建重组HMGB1-boxA表达载体。重组子同样用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，从而获得重组阳性质粒pBV220-HMGB1-boxA。将重组的阳性克隆株进行诱导，用含氨苄青霉素的LB培养基30℃培养3-5小时，再于42℃诱导3-5小时后，离心集菌，做SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果发现在9.9KD处可见一条大量表达的蛋白条带。下一步我们将进行Western blotting分析。 结论： 1.成功克隆了人成熟HMGB1-boxA基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2.通过研究构建成熟人HMGB1－boxA的原核表达载体，为人成熟HMGB1-BOXA基因在原核表达载体的表达奠定了基础。