自身免疫性肝病患者肝组织中菌群丰度和多样性的研究

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xliang677
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目的探讨运用手工裂解法和微生物试剂盒法对DNA提取的产率和纯度的差异。分析自身免疫性肝病(AILD)各亚型肝组织中菌群丰度和多样性的差异,并探究AILD患者及对照组肝组织是否存在特异性细菌,旨在为AILD发病机制的研究提供线索。方法纳入2017年8月至2018年8月在天津医科大学总医院消化科就诊的AILD患者,并无菌收取患者经肝活组织穿刺检查获得的肝组织,进行肝脏菌群的16SrRNA基因测序分析。我们运用微生物试剂盒法,收集12例AILD患者(其中4例AIH,4例PBC,4例PBC-AIH OS)(以下简称OS)和4例肝囊肿患者(对照)的无菌肝穿刺组织标本。同时运用手工裂解法,收集18例AILD患者(10例AIH患者,8例OS患者)和2例肝囊肿患者(对照)的无菌肝组织标本。其中,有6个样本同时运用了两种方法进行16SrRNA基因测序,比较两组方法对DNA提取浓度和纯度的影响。进一步地,运用手工裂解法提取肝组织DNA进而比较AILD各组及正常对照肝脏菌群的丰度及多样性的差异,基于线性判别分析效应量找出差异菌,Spearman相关性分析探讨肝脏菌群与临床指标的相关性,并对测得的16SrRNA基因序列进行代谢功能的预测。结果所有肝组织样本中均可检测到细菌。手工裂解法和微生物试剂盒法对DNA产率的影响无统计学差异(t=2.502,P=0.054),对体现提取纯度的指标OD260/OD280的影响亦无统计学差异(t=2.039,P=0.097)。在门、属及种水平上,运用手工裂解法提取DNA对OTU数量(t=6.096、6.056、6.096,P均<0.01)及Alpha多样性(Chao1丰富度指数、ACE丰富度指数、Simpson多样性指数、Shannon多样性指数)(t=7.553、7.673、4.714、9.339,P均<0.01)的影响均明显优于微生物试剂盒法。两种提取方法测得的肝组织菌落均以变形菌门为主。属水平上,微生物试剂盒法以假单胞菌属为主,而手工裂解法以嗜糖假单胞菌属为主。与对照组相比,AIH及OS组菌群丰度降低,多样性增加,但均无统计学差异。通过手工裂解法,我们发现乳酸杆菌目(LDA=4.30,P=0.002)、乳酸杆菌科(LDA=4.28,P=0.002)、乳酸杆菌属(LDA=4.30,P=0.002)在对照组富集。AIH组肺炎克雷伯杆菌丰度为对照对照组的3.27倍(0.661%vs0.202%),OS组肺炎克雷伯杆菌丰度为对照组的4.76倍(0.961%vs0.202%)。在分析各亚型特异菌丰度与临床指标关系,我们发现,乳酸杆菌丰度与ALT、IgG、ANA、AST、IgM水平呈负相关(r=-0.9461,-0.8945,-0.8776,-0.8144,-0.5564,P均<0.05),与C4及C3水平呈正相关(r=0.8848,0.8913,P均<0.05);肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)丰度与HDL(r=-0.4655,P=0.0386)水平呈负相关。菌群代谢功能的预测分析显示,和对照组相比,AILD组脂质代谢等代谢途径减弱。血清TC(r=-0.55,P=0.04)及LDL(r=-0.55,P=0.04)的水平与甘油酯代谢呈相关;血清TG(r=-0.498,P=0.026)水平与酮体的合成与降解呈负相关。结论对比两种提取方法对DNA提取效率的差异,我们发现在提取肝组织DNA时,手工裂解法较微生物试剂盒法更适合。肺炎克雷伯杆菌是AILD组特异性细菌。与对照组相比,乳酸杆菌丰度在AILD组丰度降低,且与疾病活动度呈负相关。菌群代谢功能的预测分析显示AILD组脂质代谢等代谢途径减弱。与AILD发病机制密切相关的肝脏微生物群,可能是一种潜在的诊断和治疗靶点。
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