背景与目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是人类最常见的原发性骨组织恶性肿瘤,约占所有原发性骨肿瘤的60%。随着现代医疗技术的不断发展,目前骨肉瘤患者的5年总体生存率已经接近70%。然而,对于初诊出现肺部转移或术后化疗出现局部复发耐药的患者,其5年总体生存率仅有20%,患者总体生存状况并不乐观。顺铂作为骨肉瘤治疗最广泛使用的化疗药物之一,化疗耐药性的发展严重限制了其在骨肉瘤治疗中的应用和有效性,并促使肿瘤细胞变得拮抗,导致骨肉瘤复发和预后不良。因此,深入研究骨肉瘤顺铂耐药的分子机制,寻找新的干预靶点,对骨肉瘤的临床治疗具有重要的临床意义和研究价值。近年来,越来越多的研究证实骨肉瘤细胞来源外泌体可以通过分泌一些特异性的生物活性分子,如DNA、m RNA、非编码RNA、蛋白质及脂质等来影响肿瘤微环境,从而调控肿瘤的进展和转移,并参与骨肉瘤的耐药。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是一类长度超过200个核苷酸的没有明显蛋白质编码功能的非编码RNA。研究发现,lnc RNA介导的靶点和通路失调被认为是导致化疗耐药发生的关键原因。LncRNA IGF2-AS最初被鉴定为肾母细胞瘤中IGF2位点的反义转录本,参与了人类多种癌症的发生发展,并与癌症患者预后不良密切相关。最新研究报道,IGF2-AS在胃癌、食管鳞癌、肝细胞癌、乳腺癌和Wilms肿瘤等肿瘤中均表达上调。在前期的研究工作中我们发现并证实,相较于人正常成骨细胞和骨肉瘤顺铂亲本细胞,IGF2-AS在骨肉瘤细胞系和顺铂耐药骨肉瘤细胞中显著高表达。此外,通过生物信息学分析,我们发现转录因子CTCF可以在转录水平调控IGF2-AS的表达,并且转录因子CTCF可能主要在肿瘤细胞来源的外泌体中富集。另有研究表明,CTCF作为一种多功能的核转录因子,在多种癌症中表达上调并可促进肿瘤细胞异常增殖、侵袭、转移同时诱导肿瘤细胞化疗耐药。然而,CTCF和IGF2-AS在骨肉瘤化疗耐药过程中发挥的作用及其具体调控机制尚不清楚。本课题围绕顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体传递CTCF调控IGF2-AS/miR-579-3p/MSH6轴介导自噬信号通路对骨肉瘤细胞顺铂耐药性的影响展开以下研究:（1）探索顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体传递CTCF对LncRNA IGF2-AS表达和骨肉瘤细胞顺铂耐药的影响;（2）阐明LncRNA IGF2-AS通过miR-579-3p/MSH6轴激活自噬信号通路促进骨肉瘤细胞顺铂耐药的机制;（3）明确顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体传递CTCF通过IGF2-AS/miR-579-3p/MSH6轴促进骨肉瘤细胞顺铂耐药的机制。通过本课题研究,我们将揭示顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体分泌的CTCF对IGF2-AS的调控作用,阐明IGF2-AS竞争性结合miR-579-3p调控MSH6转录水平的机制,探讨CTCF/IGF2-AS/miR-579-3p/MSH6轴在骨肉瘤细胞顺铂耐药中的生物学功能,为今后进一步改善骨肉瘤临床顺铂耐药的治疗奠定新的理论基础和提供可能的药物新靶点。材料与方法:（1）通过hTFtarget和JASPAR数据库预测转录因子CTCF与IGF2-AS启动子区的结合情况,并通过Vesiclepedia数据库分析转录因子CTCF在外泌体中的表达情况。随后,构建顺铂耐药骨肉瘤细胞系并分离鉴定顺铂耐药骨肉瘤细胞来源外泌体,通过q RT-PCR和Western-blot检测顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞来源外泌体中CTCF的表达以及顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞中CTCF和IGF2-AS的表达情况。（2）将顺铂耐药骨肉瘤细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞进行共培养,荧光显微镜下观察骨肉瘤细胞摄取外泌体的情况。将顺铂耐药骨肉瘤细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞进行共培养或在骨肉瘤细胞中改变CTCF表达,q RT-PCR分析对IGF2-AS表达的影响。此外,通过公共数据库预测IGF2-AS启动子区域CTCF的结合位点,并利用染色质免疫共沉淀实验和双荧光素酶报告基因实验验证转录因子CTCF与IGF2-AS之间的调控关系。（3）将顺铂耐药骨肉瘤细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞进行共培养联合改变IGF2-AS表达,同时使用顺铂处理骨肉瘤细胞,利用CCK-8和流式细胞术分析细胞对顺铂IC50值的变化及细胞凋亡情况。（4）将顺铂耐药骨肉瘤细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞进行共培养联合改变IGF2-AS表达,同时使用自噬激动剂雷帕霉素处理上述骨肉瘤细胞,利用透射电镜和和Western-blot分析骨肉瘤细胞中自噬小体数量和自噬相关蛋白p62、Beclin1和LC3的改变。最后,在顺铂作用的条件下,通过CCK-8和流式细胞术分析骨肉瘤细胞对顺铂IC50值的变化及细胞凋亡情况。（5）通过Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取GSE41445骨肉瘤表达谱微阵列数据集,差异分析筛选骨肉瘤显著高表达基因,联合Gene Cards数据库获取骨肉瘤相关基因,取交集获得骨肉瘤相关高表达基因。利用String数据库构建骨肉瘤相关高表达基因互作网络并筛选骨肉瘤顺铂耐药相关基因。使用Multi Experiment Matrix（MEM）数据库预测基因与基因之间的共表达关系。（6）利用亚细胞定位预测服务器lnc Locator和在线数据库lnc ATLAS预测IGF2-AS在细胞中的亚细胞定位,并通过原位杂交实验明确IGF2-AS和miR-579-3p在骨肉瘤细胞中的定位。利用Star Base数据库预测能够与IGF2-AS和MSH6靶向结合的miRNAs并获取其相互结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证IGF2-AS与miR-579-3p、miR-579-3p与MSH6之间的靶向结合关系。随后,通过q RT-PCR和Western-blot检测顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞中miR-579-3p和MSH6的表达情况。（7）在骨肉瘤细胞中改变IGF2-AS或miR-579-3p表达,通过q RT-PCR和Western-blot分析miR-579-3p和MSH6的表达变化,明确IGF2-AS、miR-579-3p与MSH6三者之间的靶向调控关系。在骨肉瘤细胞中改变IGF2-AS表达联合改变miR-579-3p的表达,利用q RT-PCR和Western-blot分析MSH6的表达变化。（8）在骨肉瘤细胞中改变IGF2-AS表达联合改变MSH6的表达,利用透射电镜和和Western-blot分析骨肉瘤细胞中自噬小体数量和自噬相关蛋白p62、Beclin1和LC3的改变。此外,在顺铂作用的条件下,通过CCK-8和流式细胞术分析骨肉瘤细胞对顺铂IC50值的变化及细胞凋亡情况。（9）将顺铂耐药骨肉瘤细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞进行共培养联合改变MSH6表达,通过q RT-PCR和Western-blot分析CTCF、IGF2-AS、miR-579-3p和MSH6的表达变化,并利用透射电镜和Western-blot分析骨肉瘤细胞中自噬小体数量和自噬相关蛋白p62、Beclin1和LC3的改变。最后,在顺铂作用的条件下,通过CCK-8和流式细胞术分析骨肉瘤细胞对顺铂IC50值的变化及细胞凋亡情况。（10）将稳定敲低MSH6表达的骨肉瘤细胞接种至裸鼠腋下构建裸鼠皮下成瘤模型,然后分别对各组裸鼠尾静脉注射顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体和腹腔注射顺铂处理,继续成瘤4周后剥离瘤体,测量各组裸鼠瘤体的质量和体积。随后,将裸鼠皮下成瘤获得的瘤体进行组织RNA和蛋白质提取,并通过q RT-PCR和Western-blot检测各组瘤体中CTCF、IGF2-AS、miR-579-3p和MSH6的表达情况。结果:（1）CTCF和IGF2-AS在顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞中表达升高,同时CTCF可富集于顺铂耐药骨肉瘤细胞来源外泌体中并在顺铂耐药骨肉瘤细胞来源外泌体中表达上调。（2）MG63细胞可以摄取顺铂耐药骨肉瘤细胞来源外泌体并传递CTCF促进IGF2-AS表达。同时,Ch IP和双荧光素酶报告基因实验证实CTCF可以靶向结合IGF2-AS并转录激活IGF2-AS表达。（3）顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体可传递CTCF促进MG63细胞增殖活力并增加细胞对顺铂的IC50值,抑制顺铂诱导的细胞凋亡;敲低IGF2-AS则可显著抑制MG63细胞的增殖活力并降低细胞对顺铂的IC50值,促进顺铂诱导的细胞凋亡。（4）顺铂耐药MG63细胞中自噬小体数量显著增加,自噬相关蛋白p62表达降低,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高。同时,顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体可传递CTCF促进MG63细胞自噬,细胞中自噬小体数量增加,自噬相关蛋白p62表达降低,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;敲低IGF2-AS则可显著抑制MG63细胞自噬,细胞中的自噬小体数量减少,自噬相关蛋白p62表达升高,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。此外,在此基础上加入自噬激动剂雷帕霉素可逆转MG63细胞中自噬水平,并促进细胞增殖活力,增加细胞对顺铂的IC50值,同时抑制顺铂诱导的细胞凋亡。（5）生物信息学预测发现TIMP1、MSH6和FGF2为骨肉瘤顺铂耐药相关基因,其中MSH6为最核心的骨肉瘤顺铂耐药相关基因。KEGG通路富集分析发现MSH6主要作用于Mismatch repair、Platinum drug resistance和Colorectal cancer通路。公共数据库预测发现IGF2-AS与MSH6表达呈显著正相关。（6）生物信息学分析和原位杂交实验证实IGF2-AS主要定位于骨肉瘤细胞质中。Star Base数据库预测得到4个可能与IGF2-AS和MSH6靶向结合的miRNA,双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实miR-579-3p可以同时与IGF2-AS和MSH6靶向结合。此外,miR-579-3p在顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞中表达降低,而MSH6在顺铂耐药和敏感骨肉瘤细胞中表达升高。（7）在MG63细胞中过表达IGF2-AS可以抑制miR-579-3p表达,而敲低IGF2-AS则可促进miR-579-3p表达;在MG63细胞中转染miR-579-3p mimic可以抑制MSH6表达,而转染miR-579-3p inhibitor则可促进MSH6表达。此外,在MG63细胞中过表达IGF2-AS可以促进MSH6表达,而在细胞中转染miR-579-3p mimic后,过表达IGF2-AS对MSH6表达的促进作用可被逆转,MSH6表达降低。（8）在MG63细胞中过表达IGF2-AS可以促进细胞自噬,细胞中自噬小体数量增加,自噬相关蛋白p62表达降低,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;而敲低MSH6则可逆转细胞的自噬水平,细胞中自噬小体数量减少,自噬相关蛋白p62表达升高,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。此外,过表达IGF2-AS可以促进MG63细胞增殖活力并增加细胞对顺铂的IC50值,抑制顺铂诱导的细胞凋亡;而敲低MSH6则可逆转上述结果,MG63细胞的增殖活力和对顺铂的IC50值均降低,同时顺铂诱导的细胞凋亡增加。（9）顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体可传递CTCF促进MG63细胞中IGF2-AS和MSH6表达,抑制miR-579-3p表达,并激活细胞自噬,促进MG63细胞增殖活力并增加细胞对顺铂的IC50值,同时抑制顺铂诱导的细胞凋亡;而敲低MSH6不影响细胞中CTCF、IGF2-AS和miR-579-3p的表达,但可逆转顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体传递CTCF激活的细胞自噬,抑制MG63细胞增殖活力并降低细胞对顺铂的IC50值,同时促进顺铂诱导的细胞凋亡。（10）裸鼠皮下成瘤实验结果显示,通过裸鼠尾静脉注射顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体同时腹腔注射顺铂可以促进MG63细胞裸鼠皮下成瘤能力,增加瘤体质量和体积,而敲低MSH6后裸鼠皮下成瘤能力则被逆转,瘤体质量和体积均显著减少。此外,体内实验进一步证实,顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体可传递CTCF促进体内骨肉瘤中IGF2-AS和MSH6表达,抑制miR-579-3p表达,但敲低MSH6不影响瘤体中CTCF、IGF2-AS和miR-579-3p的表达。结论:（1）转录因子CTCF在顺铂耐药骨肉瘤细胞及其外泌体中显著高表达,并可通过外泌体传递转录激活IGF2-AS表达诱导自噬信号通路促进骨肉瘤细胞顺铂耐药。（2）LncRNA IGF2-AS在顺铂耐药骨肉瘤细胞中显著高表达,并可通过调控miR-579-3p/MSH6轴激活自噬信号通路促进骨肉瘤细胞顺铂耐药。（3）顺铂耐药骨肉瘤细胞外泌体可传递CTCF通过IGF2-AS/miR-579-3p/MSH6轴激活自噬信号通路促进骨肉瘤细胞顺铂耐药。