论文部分内容阅读
近年来，我国西北有色金属研究院开发了新型近β型TLM钛合金，而良好的种植体材料要求具有生物活性，能促进牙周组织和骨组织细胞黏附、增殖、分化，分泌更多蛋白，因此种植体表面改性成为当今种植体材料研究的热点方向。维护牙种植体远期成功除了良好的骨结合外，种植体周围软组织的健康也起了至关重要的作用。种植体周围的结合上皮与天然牙相似，以半桥粒和基底板附着于种植体表面。而种植体与结缔组织的结合存在争议。牙龈成纤维细胞作为牙龈结缔组织中最主要的细胞，故研究牙龈成纤维细胞在微弧氧化水热处理TLM钛合金表面的生物学行为对进一步临床应用具有一定的指导意义。目的:本课题采用微弧氧化水热处理技术在新型近β型TLM钛合金表面制备了含有TiO2/HA的复合陶瓷涂层。通过体外细胞评价TLM-MAO-HS表面复合涂层对人牙龈成纤维细胞生物学行为的影响，研究该材料与周围软组织的关系。并初步探讨一定浓度的内毒素（LPS）对体外培养的牙龈成纤维细胞在不同时间段分泌IL-6、MMP-1的影响。研究微弧氧化水热处理TLM钛合金诱发的早期炎症反应，为今后的临床应用提供实验依据。方法：利用微弧氧化技术对TLM钛合金表面进行电化学处理，使其形成一粗糙多孔、具有一定厚度和强度的TiO2陶瓷氧化层，结合经过水热处理后使TLM钛合金TiO2陶瓷氧化层基础上形成纳米级HA晶体。通过场发射扫描电镜、X线衍射分析、能谱仪分析、接触角检测仪等对材料的表面形貌、粗糙度、物相结构、表面润湿性等进行检测。将原代培养的人牙龈成纤维细胞分别接种在光滑TLM钛合金和TLM-MAO-HS表面培养，通过免疫荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、CCK8等观察检测HGF的早期黏附、细胞形态及增殖情况。ELISA检测LPS诱导下HGF在光滑Ti、TLM合金和TLM-MAO-HA表面培养6h、24h、48h后分泌IL-6、MMP-1表达量的差异。结果：（1）扫描电镜下观察微弧氧化水热处理后钛片表面，可见一微米级粗糙多孔的TiO2/HA生物陶瓷氧化层，呈火山口状，孔径约2-5μm，表面纳米级HA针状晶体均匀分布，其中钙磷比为1.58。表面粗糙度检测得知微弧氧化水热处理TLM合金的粗糙度为微米级，为1.59±0.056μm。表面接触角检测MAO-HS组钛合金小于光滑组。（2）细胞早期黏附：用DAPI染料对接种在光滑TLM钛合金和TLM-MAO-HS表面2h、4h、8h后的人牙龈成纤维细胞细胞核染色，荧光显微镜下计数细胞个数。接种4h、8h后，MAO-HS组细胞数量明显多于光滑组，且有统计学差异（P <0.05）。细胞形态：激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察HGF接种在光滑TLM钛合金和TLM-MAO-HS表面24h后的细胞形态变化，发现HGF在光滑组沿着抛光纹路排列，呈细长梭型。而MAO-HS组表面呈纺锤型生长，细胞铺展面积较大。扫描电镜下可见培养6h后细胞未完全伸展，呈圆形。而MAO-HS组细胞伸出伪丝和丝状伪足。培养24h后可见光滑组细胞伸展，而MAO-HS组HGF细胞铺展明显增大。细胞增殖：CCK8法检测HGF接种在光滑组和MAO-HS组钛合金表面1d、3d、5d、7d后的细胞增殖数量，发现培养1d后，各组的细胞增殖数量无明显差异。但培养3d、5d、7d后MAO-HS组材料表面的细胞数量明显多于光滑组，且有统计学差异。（3）利用ELISA法检测LPS诱导下HGF在光滑Ti、TLM钛合金和TLM-MAO-HS表面培养6h、24h、48h后分泌IL-6、MMP-1的表达情况。结果显示HGF接种MAO-HS组表面6h后的IL-6平均表达量多于光滑组，但无统计学意义。但培养24h、48h后，MAO-HS组IL-6平均表达量明显多于光滑组，且有统计学意义（P <0.05）。培养6h、24h、48h后，HGF在MAO-HS组表面分泌MMP-1较多，但无统计学意义。结论：采用微弧氧化水热处理技术可在新型近β型TLM钛合金表面原位形成一微米级粗糙多孔、表面均匀分布HA的二氧化钛陶瓷氧化层，其Ca/P比为1.58。TLM-MAO-HS钛合金能促进HGF的早期黏附、细胞铺展和增殖。体外实验结果显示不能认为TLM-MAO-HS钛合金诱发明显的早期炎症反应。