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目的:肺高压(PH)是肺血管阻力持续升高,右心室负荷不断增加,进而导致进行性右心衰竭甚至死亡的常见严重并发症。近年来研究认为肺血管炎症及血管细胞内质网应激反应在PH的发生发展中起重要作用。二十二碳六烯酸(DHA)是n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)的主要成分,具有调节内质网应激及抗炎等效应。我们前期研究发现DHA能改善低氧性肺动脉高压。本研究拟采用野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺高压模型,进一步探讨DHA的防治肺高压作用及其机制。方法:1.实验动物分组:SD (200-250 g)大鼠40只,每组10只,随机分为4组:对照组(生理盐水注射),MCT造模组(腹腔单次注射MCT,4周),MCT造模组+DHA灌胃预防组(腹腔注射MCT当天即给予DHA灌胃,持续4周),MCT造模+DHA治疗组(腹腔注射MCT两周后给予DHA每天灌胃,持续2周)。(1)右心导管法检测各组大鼠肺动脉平均压;沿室间隔分离右心室(RV),左室+室间隔(LV+S)分别称取质量,计算右心室肥厚指数:RV/ (LV+S) ; (2)实时定量PCR检测肺组织细胞因子IL6,TNF-α,MCP-1及IL1β基因表达;(3)免疫组化法检测①肺动脉中膜厚度②肺组织及阻力性肺动脉周围CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞计数;(4)免疫印迹法检测肺组织内质网应激相关蛋白表达水平;(5)免疫荧光双染检测内质网应激相关蛋白在肺组织中膜的表达差异。2.组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)并进行免疫荧光细胞鉴定。(1)免疫印迹及细胞免疫荧光检测PASMC内质网应激蛋白表达水平;(2)实时定量PCR检测PASMC的NFATcl-4基因表达水平;(3)免疫印迹检测NFATcl的总蛋白水平及核转移情况;(4)CCK8及BrdU摄入检测PASMC增殖;(5)流式细胞术检测PASMC细胞周期;(6)免疫印迹检测细胞周期相关蛋白表达水平。结果:(1)与对照组大鼠相比,MCT组大鼠4周后平均肺动脉压显著升高(MCT: 48.2±3.1 mmHg vs control: 20.5±1.3 mmHg;p<0.05) ; DHA预防及治疗可显著降低MCT诱导的PH大鼠平均肺动脉压(MCT+DHA预防组:25.3±2.1mmHg; MCT+DHA 治疗组:31.5±3.4mmHg;p<0.05 vs MCT组)及右心指数(MCT+DHA预防组:0.37±0.02;]MCT+DHA治疗组:0.42±0.01; p<0.05vsMCT组);并显著抑制MCT诱导的大鼠肺动脉中膜增厚。(2) DHA预防及治疗可显著减少MCT诱导的大鼠肺组织IL1β,TNFα,IL-6和MCP-1基因表达(p值均<0.05);并抑制MCT诱导的大鼠肺组织及肺血管周围CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞的聚集。(3) DHA预防及治疗可显著减少MCT诱导的大鼠肺组织内质网应激相关蛋白p-IRE1,PDI和GRP78蛋白表达(p值均<0.05);免疫荧光双染表明DHA主要减少肺动脉平滑肌层PDI的表达。(4)在培养的PASMC,PDGF-BB刺激能显著增加内质网应激相关蛋白p-IRE1,PDI和GRP78蛋白表达(p值均<0.05)而DHA预孵能抑制PDGF-BB诱导的内质网应激相关蛋白的表达;免疫荧光表明PDGF-BB刺激PASMC后PDI荧光信号增强,而预孵DHA能减弱荧光信号。(5)PDGF-BB 刺激能诱导 PASMC 的 NFATc1,NFATc2 及 NFATc3基因表达增加(p<0.05 vs对照组)而对NFATc4无显著影响;预孵DHA能逆转PDGF-BB诱导的NFATc1及NFATc2的基因表达,而对NFATc3无显著影响。(6) PDGF-BB刺激能诱导PASMC的NFATc1总蛋白表达增加,蛋白核转移增多,而预孵DHA及内质网应激抑制剂4-PBA能产生类似的抑制PDGF-BB诱导性NFATc1总蛋白表达增加及活性增强。(7) PDGF-BB刺激PASMC能显著促进细胞周期蛋白cyclin D1表达,抑制G1期相关负性蛋白p21和p27表达,处于细胞周期S期百分比增多,细胞增殖增加;而DHA预孵或NFATc1 siRNA干扰能产生类似的抑制PDGF-BB诱导的cyclinD1表达增加,恢复p21和p27的蛋白水平,将细胞阻滞于G1期,抑制PDGF-BB诱导的PASMC的增殖。结论:(1) DHA抑制MCT诱导的PH的肺组织及肺血管周围炎症反应。(2) DHA抑制PDGF-BB诱导的PASMC内质网应激,减少PASMC增殖,改善肺血管重塑,降低MCT诱导的大鼠PH平均肺动脉压。