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羊支原体性肺炎是绵羊和山羊中广泛流行的高度接触性传染病。在我国,该病的主要致病菌是丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc）和绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）。相比于Mmc,Mo人工培养困难,且难以连续传代,因而限制了分离培养法和血清学方法在检测中的应用,加之Mo的生长滴度低,无法进行扩大培养来大量的收集抗原,导致该病传统疫苗的研发受到了制约。本研究采用RNA-seq技术分别对Mo NM151株和Mmc PG3株不同生长阶段的样本进行测序及生物信息学分析,以Mmc为参考,找出可能影响Mo生长代谢的关键点（基因）、代谢缺陷,提出Mo培养基的优化方案,最后进行培养试验加以验证。1.本文在确定Mmc PG3株和Mo NM151株生长曲线的基础上,选取两者对数期（log）、稳定期（sta）、衰亡期（dec）、衰亡期后期（latedec）及NM151株的死亡期（die）共9个时间点、27个样本进行转录组测序。2.PG3株四个不同生长时期测序的12个样本中,得到的Reads数及饱和度均能满足试验要求。四个生长时期的相邻点比较中共得到445个差异表达基因（DEGs）,其中有64个差异表达基因富集到28个代谢通路上。文中选取了差异基因富集数多的6个代谢通路进行比较分析,结果发现:对数期时,与糖酵解和核苷酸代谢相关的差异基因的表达量最高;到了稳定期,参与甘油磷脂、烟酸和烟酰胺代谢的相关基因表达量逐步升高;衰亡期和衰亡期后期,糖酵解和核苷酸代谢的相关基因表达量小幅升高;编码氨酰t RNA连接酶的基因数量最多,在整个生长周期均有升高和降低,其中编码谷氨酰-t RNA连接酶的基因（EXU60218）在稳定期和衰亡期后期均显著上调表达,促进了谷氨酸的合成。我们推测,这可能是PG3株应对培养环境中不断变化渗透压的一种自我保护方式。3.NM151株五个生长时期测序的15个样本中,得到的Reads数及饱和度均能满足试验要求,共得到307个DEGs,其中有45个差异基因与代谢相关。前4个生长时期相邻点比较中的DEGs少,共有13个。对数期和稳定期比较组（NM151-log vs.NM151-sta）中有5个,稳定期和衰亡期比较组（NM151-sta vs.NM151-dec）中有7个,这些基因富集到了糖酵解、核苷酸代谢等通路上,甘油磷脂代谢未富集到差异基因;衰亡期后期与死亡期的比较组（NM151-latedec vs.NM151-die）中共有32个DEGs;编码氨酰t RNA连接酶的基因数量较少。4.本研究分两步对PG3株和NM151株的代谢特点进行组间比较。第一步,从PG3株和NM151株的差异基因总体来看,随着培养时间的延长,PG3株中大部分基因的表达量下降后在衰亡期或衰亡期后期有小幅升高,而NM151株中的基因表达量持续下降;90%的“Shared DEGs”在PG3株中高表达,这其中包含了Dank蛋白、PTS转运系统酶ⅡBC、核糖/半乳糖ABC转运蛋白,ATP合成酶α、β亚基、果糖-2-磷酸醛缩酶-II和甘油激酶等代谢关键酶。PG3株中“Spesific DEGs”的数量多于NM151株,编码这些蛋白基因的富集和显著高表达提高了PG3株对营养物质的转运、自身能量的产生、自我保护能力,保证了其关键代谢的顺利进行。5.根据以上PG3株和NM151株在整个生长周期的代谢特点比较结果,我们提出四种Mo培养基改良方案并进行试验验证。结果如下:在普通支原体培养基中添加Hepes或丝氨酸可在36 h将最高活菌数提高两倍,提高了葡萄糖含量的培养基,其活菌数在48 h达到最高;它们均能将Mo稳定期延长约12 h;Hepes有效的维持了培养基的p H,添加Hepes培养基中Mo的活菌数在整个衰亡期最高。以上结果说明,通过转录组测序对Mo和Mmc不同生长时期的代谢进行比较分析提出的改良培养基延长了Mo的稳定期,将Mo的最高生长滴度由原来的10亿CFU/m L提高到20亿CFU/m L。参考本研究团队用Mo灭活苗免疫动物的试验结果,若将该生长滴度的Mo制备灭活苗,每只羔羊免疫1 m L就可获得良好的免疫效果,且灭活苗制备的整个过程无需浓缩,简化了操作,降低了生产成本,减少了时间成本。本文是解决Mo难培养、活菌数低、难以连续传代的一种新方法,新思路。为Mo培养基的改良提供了理论依据,也为其灭活苗制备打下了基础。