种子细胞是组织工程研究与应用中最为关键的要素之一，是组织工程化组织能够再生的首要物质基础。目前研究所用的种子细胞从来源上可以划分为自体细胞、同种异体细胞和异种细胞。从分化程度上可以划分为胚胎干细胞、成体干细胞、定向祖细胞和分化成熟细胞。同种异体细胞和异种细胞虽然来源较为广泛，但存在免疫排斥和细胞功能差异等问题，胚胎干细胞则很难获得定向分化纯度较高的种子细胞，而且还存在伦理问题，因此目前真正用于组织工程化组织构建与组织缺损修复的种子细胞仍然是以自体来源的干细胞为主。作为组织工程种子细胞应满足如下几点要求：体外扩增能力强，能进行大规模的扩增；活力和功能良好，具备构建组织的特定生物学性能；细胞纯度高，具备特定的生物学功能的细胞占主导；不发生免疫排斥反应；生物安全性好。骨髓间充质干细胞恰恰符合上述要求，并且其来源广泛，数量充足，体内可再生；取材安全方便，供区创伤较小；细胞培养技术简单易行。但组织工程应用时所需要的种子细胞是大量的，单纯的体外扩增培养很难在有限时间内扩增出所需要的量，于是，寻找可以高效体外扩增骨髓间充质干细胞的方法势在必行。目前的研究显示，特定序列的寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)对人牙周膜细胞、大鼠骨髓间充质干细胞、牙龈卟啉单胞菌感染成骨细胞和MG63细胞的增殖具有显著的促进作用。故我们建立了“一定浓度的特定序列寡核苷酸可能促进hBMSCs的增殖”这样一个科学假设，利用CCK-8、实时荧光定量PCR等检测技术分别对增殖和影响机制进行探索，为ODN的基础研究和临床应用提供一定的理论参考。实验分为如下五个部分：第一部分.hBMSCs的分离、培养及鉴定密度梯度离心法获取健康成人hBMSCs，观察期细胞形态，取第3代hBMSCs以1.0×104/cm2的密度接种于6孔板，分别加入成骨、成脂和成软骨诱导液，每72h换液，2-3周后分别进行茜素红、油红O和甲苯胺蓝染色，干细胞表面分子的流式细胞仪鉴定。第二部分.hBMSCs最佳铺板浓度的确定将第3代hBMSCs分别以3.0×103/cm2、6.0×103/cm2、1.2×104/cm2、2.4×104/cm2的浓度接种于96孔板，每孔200ul完全培养基，第4天换液，酶标仪检测CCK-8（测定波长450nm，参比波长630nm）光密度值，连续检测7天，观察生长曲线，确立最佳铺板密度。第三部分.ODN saf5、FC003、MT01对hBMSCs增殖的影响将第3代hBMSCs以最佳铺板密度接种于96孔板，每孔200ul完全培养基，依据ODN种类（MT01、FC003、Sa05f）和终浓度（0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，4.0mg/L）分为12个实验组，每组4复孔，对照组加入等量PBS，酶标仪检测CCK-8（测定波长450nm，参比波长630nm）光密度值，连续检测3天，确立对hBMSCs增殖有影响的ODN。第四部分.ODN MT01对hBMSCs细胞周期的影响将第3代hBMSCs以最佳铺板密度接种于6cm培养皿，细胞贴壁后，实验组加入ODN MT01使其终浓度为2.0mg/L，对照组加入等量PBS，检测时间点为加入ODN后第1，2，3天，样本处理及检测方法依照Muse Cell Analyzer相应试剂盒操作。第五部分.ODN MT01影响hBMSCs细胞周期的机制hBMSCs处理方法同1.3.4，样本处理及检测方法依照LightCycler@480实时荧光定量PCR仪相应试剂盒操作，检测cyclin A、Cyclin D1、CDK2和CDK4四种蛋白的在加入ODN MT01后第2天的表达情况。实验结果如下：第一部分密度梯度离心法分离培养纯化的细胞生长良好，第3代hBMSCs单个成纺锤形，大量增殖后呈旋涡状排列;成骨诱导21天后，培养皿中固定细胞后茜素红染色，可见大量橘红色的矿化结节；成脂诱导15天后，培养皿中固定细胞后油红O染色，可见大量的暗红色脂滴形成；成软骨诱导21天后，培养皿中固定细胞后甲苯胺蓝染色，可见胞浆中的淡蓝色异染颗粒及细胞外基质被染成浅蓝色;经流式细胞仪检测，细胞CD90的阳性表达率为99.6%；细胞CD73的阳性表达率为99.9%；细胞CD105的阳性表达率为96.5%;细胞CD34/45/116的综合阳性表达率为0.51%。第二部分根据CCK-8连续检测7天的结果绘制的生长曲线显示，以6×103/cm2为铺板密度的hBMSCs生长曲线最佳。第三部分在加入每种不同浓度的ODN后，与对照组相比，终浓度为0.5mg/L的ODNFC003在第1天检测到吸光值显著升高（P<0.01）；终浓度为1.0mg/L和4.0mg/L的ODN Sa05f在第1天检测到吸光值均显著降低（分别为P<0.01，P<0.05）；终浓度为2.0mg/L的ODN MT01在连续3天内的吸光值均明显升高，差异具有统计学意义（第1天P<0.01，第2,3天P<0.05）。第四部分.细胞周期检测结果显示，与相应对照组比较，实验组第1,2,3天的G0/G1期细胞百分比明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；S期和G2/M期的细胞百分比明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。第五部分ODN MT01处理后第2天的实时荧光定量结果显示，与对照组相比，实验组中Cyclin A、Cyclin D1、CDK2和CDK4的表达升高，其差异具有统计学意义（P<0.01）.以上实验结果证实：本实验利用密度梯度离心法分离纯化的hBMSCs，在标准的培养条件下MSCs能贴塑料瓶壁生长；在体外能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化；符合Dominici M[8]于2006年在Cytotherapy杂志上发表了关于人的MSCs鉴定的最低标准，为实验的后续研究奠定基础；以6.0×103/cm2的接种密度铺板可获得良好的细胞生长曲线；终浓度为2.0mg/L的ODN MT01可显著促进hBMSCs的增殖；与对照组相比，降低了G0/G1期的细胞百分比，提高了S期、G2/M期的细胞百分比；其分子机制可能但不局限于通过调高cyclin A、Cyclin D1、CDK2和CDK4四种蛋白的表达而实现的。总之，作为抑制型寡核苷酸的ODN MT01可以调节细胞周期相关调控因子来促进hBMSCs的增殖；本研究为组织工程种子细胞的体外扩增提供了新的思路和一定的理论参考；然而，对于ODN MT01的实际应用，我们还需要大量的工作来实现。