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茉莉酮酸是由脂肪酸衍生而来的环戊酮化合物,在农业、香精香料、医药行业具有广阔的应用前景。目前植物中茉莉酮酸的合成途径已较为清楚,但真菌中对茉莉酮酸合成的研究还局限于同位素示踪法以及相关前体/代谢物质的检测。本实验室前期筛选到发酵产茉莉酮酸的伊朗二孢菌（Lasiodiplodia iranensis）,为提高其生产茉莉酮酸的产量,本文以L.iranensis为研究对象,通过发酵产物的GC-MS分析、基因组的测序分析、合成途径关键酶的挖掘及其体外催化验证,初步确定10R-LOX（10R-lipoxygenase）是茉莉酮酸合成的关键酶;通过添加前体α-亚麻酸发酵,茉莉酮酸的产量可提高1倍以上。具体如下:（1）发酵液中茉莉酮酸类物质的检测。发酵液甲酯化后,利用GC-MS法检测,茉莉酮酸类物质的最大占比为80.26%,其中茉莉酮酸为主要成分,最大占比为78.05%,其次为二氢茉莉酮酸,最大占比为2.21%,顺式茉莉酮含量甚微,仅占0.17%。（2）L.iranensis基因组测序结果分析。利用Illumina HiSeq测序平台对L.iranensis进行de novo测序,得到了43.01 M的基因组序列,GC含量为54.82%,包含78个scafolds,N50为1.08 M。利用软件Prokka结合swiss-prot库的注释文件预测了11224个基因,通过与GO、COG、KEGG数据库的比对,注释了7360个基因,注释率为65.57%。在注释数据中挖掘到了4个茉莉酮酸合成候选基因:1个脂氧合酶（10R-LOX）,3个β-氧化酶（3-酮酰辅酶A-硫解酶（KAT1、KAT2）、乙酰辅酶A氧化酶（ACX））。系统发育以及结构域的分析表明了KAT1、KAT2、ACX注释信息的准确性,10R-LOX具有过氧化物酶和p450酶的结构域,是一种融合蛋白。（3）候选基因转录表达水平验证。根据4个目的基因序列,设计引物,进行RT-PCR分析,4个基因均得以转录。选择延伸因子（EF1α,Elongation factor 1-α）作为内参基因进行qRT-PCR实验量化基因表达,结果表明L.iranensis发酵过程中4个基因表达量均正相关于茉莉酮酸的产量,其中10R-LOX相关性最强,相关系数为0.96。（4）10R-LOX功能验证。在E.coli BL21中克隆表达10R-LOX,收集可溶性表达部分进行α-亚麻酸的催化反应,LC-MS分析催化产物,发现了氢过氧化物以及α、γ-酮（由AOS催化氢过氧化物而生成）的存在。且该酶结构域中存在10R-DOX以及AOS的保守基序,推测该酶催化茉莉酮酸合成途径的前两步。（5）L.iranensis发酵产茉莉酮酸试验。L.iranensis静置发酵96 h,补加30 g·L-1的蔗糖,茉莉酮酸的产量为1.99 g·L-1;L.iranensis静置发酵72 h,补加3 g·L-1α-亚麻酸,茉莉酮酸的产量达到2.9 g·L-1,分别比对照提高了1.28、1.63倍。L.iranensis静置发酵可重复两批次发酵,第二批次茉莉酮酸产量为首批的101.5%,发酵周期缩短。