【摘 要】
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目的脑胶质瘤是最常见的颅内原发恶性肿瘤,因胶质瘤细胞具有高度浸润性生长特点,目前尚无有效的根治方法。外泌体是一类具有纳米尺寸的囊泡结构,通过运输来自受体细胞的生物活性物质在细胞间物质交换与信息传递中发挥重要作用,是一类新型的理想药物载体。miR-181c是一类微小RNA,可通过外泌体运输到受体细胞,调控受体细胞的多种生物学行为,在脑胶质瘤治疗中发挥了重要功能。本课题通过慢病毒稳定转染技术制备过表达
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目的脑胶质瘤是最常见的颅内原发恶性肿瘤,因胶质瘤细胞具有高度浸润性生长特点,目前尚无有效的根治方法。外泌体是一类具有纳米尺寸的囊泡结构,通过运输来自受体细胞的生物活性物质在细胞间物质交换与信息传递中发挥重要作用,是一类新型的理想药物载体。miR-181c是一类微小RNA,可通过外泌体运输到受体细胞,调控受体细胞的多种生物学行为,在脑胶质瘤治疗中发挥了重要功能。本课题通过慢病毒稳定转染技术制备过表达miR-181c的间充质干细胞,进而获得miR-181c修饰外泌体,并通过体外实验探究miR-181c修饰外泌体对脑胶质瘤细胞增殖与细胞凋亡的调控作用。方法1.分离培养人脐带间充质干细胞,利用流式细胞术检测其表面标志物蛋白（CD105、CD90、CD44、CD34）表达情况以进行细胞纯度鉴定;利用慢病毒载体介导的基因稳定表达策略制备过表达miR-181c的脐带间充质干细胞,real-time PCR技术检测修饰后细胞中miR-181c表达水平。2.超速离心法抽提分离细胞培养上清液中外泌体,透射电子显微镜观察外泌体形貌及粒径大小,纳米颗粒示踪技术检测外泌体粒径分布及浓度,Western blotting技术检测外泌体标志物蛋白（CD63、CD9和TSG101）表达情况,real-time PCR技术检测不同细胞来源外泌体中miR-181c表达水平。3.培养人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87 MG;野生型外泌体及miR-181c修饰外泌体分别孵育处理U-87 MG细胞,real-time PCR技术检测细胞中miR-181c含量,CCK-8试剂盒检测细胞活力变化,免疫荧光标记和Western blotting技术检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果1.分离培养人脐带间充质干细胞,流式细胞术检测结果显示所培养间充质干细胞显示几乎均表达CD105、CD90,几乎不表达CD44、CD34,纯度超过98%;携带miR-181c的慢病毒载体能够明显提高间充质干细胞中miR-181c表达水平。2.透射电子显微镜观察显示不同来源外泌体均呈圆形或椭圆形,且具有典型的双层生物膜结构;纳米颗粒示踪技术检测两组外泌体粒径分布在30～150 nm且浓度差异不大;Western blotting技术检测两组外泌体均表达外泌体标志物蛋白CD63、CD9和TSG101;real-time PCR检测结果显示miR-181c修饰外泌体中miR-181c具有显著性富集水平。3.脐带间充质干细胞来源外泌体能够被U-87 MG细胞所摄取;显著性补充U-87 MG细胞中miR-181c水平,能够降低U-87 MG细胞活力,抑制U-87 MG细胞增殖,并促进U-87 MG细胞凋亡的发生;与野生型间充质干细胞来源外泌体处理组相比,miR-181c修饰外泌体对胶质瘤细胞的治疗作用更显著。结论miR-181c修饰外泌体对脑胶质瘤细胞具有更好的治疗作用,能更有效的抑制胶质瘤细胞的活性和细胞增殖,促进胶质瘤细胞的凋亡。本课题的实施可为间充质干细胞来源外泌体应用于脑胶质瘤的临床治疗提供新思路和新方法。
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