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视神经损伤是临床常见的眼外伤，迄今仍缺乏有效的治疗手段。视神经损伤的再生修复已引起眼科工作者的广泛关注；同时作为中枢神经损伤修复经典的研究模型，其研究成果对中枢神经损伤修复也具有重要的理论价值。目前已被证明可以促进成年哺乳动物RGCs轴突再生的方法有：补充外源性神经营养因子(NTFs)；中和或减少神经生长抑制因子等。研究证实多种NTFs(如NGF、BDNF、FGF、CNTF)对体外培养及视神经横断伤后RGC的存活有明显促进作用，为轴突再生提供了前提条件。多数NTFs能促进RGCs存活, 但不能使轴突长距离生长，更无法达到功能性修复；在体外实验中，神经生长抑制因子的抗体(IN-1)能中和其抑制作用，促进培养神经元轴突再生，但由于其一过性效应，难以在体内发挥作用。1999年Cui等首次报道睫状神经营养因子(CNTF)可明显促进RGC轴突再生，CNTF治疗组轴突再生数量是对照组的4-25倍。近端轴突横断模型RGCs较远端横断模型对CNTF更敏感。Cui等认为系后者保留较长神经干上的少突胶质细胞产生神经生长抑制因子影响其再生能力所致。 现已证实，少突胶质细胞产生的神经生长抑制因子是一种膜蛋白，对视神经轴突再生具有强烈的抑制作用。2000年，有三个实验室同时报道了一个未知基因——Nogo基因，它编码这种抑制性蛋白。这一重要成果给视神经损伤修复的研究带来了新的希望。根据这一新的研究成果，我们认为如果能通过有效手段人为调控Nogo基因的表达，减少或阻止神经生长抑制因子(Nogo-A)的产生，同时补充外源性神经营养因子，有可能达到促进损伤视神经再生修复以及功能恢复的目的，减少各种原因损伤视神经而造成的失明。本研究目的——采用反义核酸调控Nogo基因的表达，减少或阻止视神经生长抑制因子(Nogo-A)的产生，同时补充外源性CNTF，提高损伤视神经的再生潜力和修复效果，为治疗视神经损伤提供新的策略，同时也为研制临床治疗视神经损伤的反义核酸药物提供实验依据。本课题进行了以下5个方面的研究：1.采用原位杂交技术观察Nogo-A mRNA在<WP=10>中枢神经系统及周围神经系统表达和分布的差异，了解在视神经封闭Nogo基因的可行性；2.了解视神经损伤后Nogo基因的表达变化；3.通过视神经少突胶质细胞培养实验，筛选反义寡核苷酸及有效浓度；4.通过细胞培养实验证实CNTF对RGCs存活的促进作用并了解其作用机制；5.通过动物实验了解联合使用CNTF和ASODN在视神经损伤修复中的作用。主要结果和结论如下：1. 首次采用视神经组织块法及化学限定性培养基，建立了少突胶质细胞的培养方法。该方法较传统培养方法获得的少突胶质细胞数量多，纯度高，操作简便易行。为少突胶质细胞培养提供了一个简便而有效的方法，为本研究筛选Nogo-A反义核酸奠定了基础。 2. 采用原位杂交技术证实，Nogo-A mRNA在视神经、脑、脊髓、培养视神经少突胶质细胞表达阳性，坐骨神经Nogo-A mRNA表达阴性。在大鼠中枢神经组织及视神经少突胶质细胞中Nogo-A mRNA广泛分布，而在周围神经则无Nogo-A mRNA表达，提示Nogo-A mRNA阳性表达及分布与中枢神经系统再生功能低下密切相关。3. 大鼠正常视神经组织中表达Nogo-A mRNA, 但表达量较低；视神经损伤后3天，Nogo-A mRNA的表达增高，并持续至伤后25天。提示视神经损伤后Nogo基因表达增加，损伤可能激活Nogo对视神经的再生抑制作用。4. 细胞培养实验显示，Nogo-A反义寡核苷酸可被少突胶质细胞直接摄取；Nogo-A反义寡核苷酸可有效、特异地抑制少突胶质细胞Nogo-A mRNA的表达，阻碍神经生长抑制因子(Nogo-A)的合成。浓度为2(M-10(M的反义寡核苷酸即能有效抑制Nogo-A mRNA的表达；当其浓度大于15(M时，有毒性反应。5. 在体实验显示，浓度为2(M的Nogo-A反义寡核苷酸即能有效抑制大鼠视神经Nogo-A mRNA的表达。提示较低浓度的反义寡核苷酸通过局部应用可有效阻抑视神经Nogo-A mRNA的表达。6. 大鼠视网膜神经节细胞培养实验证实，CNTF能延长视网膜神经节细胞的存活时间，增加视网膜神经节细胞存活的数量。同时发现不同浓度(10ng.ml-1、20ng.ml-1、40ng.ml-1)的CNTF中，20ng.ml-1CNTF促视网膜神经节细胞促存活作用最明显，在浓度达到40ng.ml-1时表现出毒性作用。7. 流式细胞仪检测证实，无血清培养基能诱导视网膜神经节细胞的凋亡，CNTF能减少视网膜神经节细胞的凋亡，提示CNTF通过减少视网膜神经节细胞凋亡来促进神经节细胞存活。8. bcl-2蛋白定量检测显示，CNTF促进培养的视网膜神经节细胞bcl-2蛋白的表达。提示CNTF减少RGCs凋亡可能与其促进bcl-2基因表达有关，CNTF通过提高<WP=11>bcl-2基因表达减少神经节细胞凋亡可能是CNTF促进视网膜神经节细胞存活的机理之一。9. 动物实验证实，CNTF与Nogo-A反义寡核苷酸均能促进钳夹伤视神经部分RGCs再生修复，两者联合使用显著促进了其修复效果。这一研究结果为治疗视神经损伤提供了新的思路，同时也为开发临床治疗视神经损伤的反义核酸药物提供了实验依据。