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核酸适配体是一种能和靶分子特异性结合的人工体外合成的单链寡核苷酸,其靶分子可以是离子、小分子、蛋白质甚至整个细胞。近年来,适配体作为分子识别探针已经在医疗诊断、化学分析、环境检测、食品安全等方面发挥了重要作用。在基于适配体的分析研究中,凝血酶的两种适配体是短链,合成成本低,而且它们可与凝血酶的不同位点结合,形成三明治结构,同时不影响凝血酶的催化活性,因此凝血酶与其适配体是最常见的研究对象。但是这些研究大多数都集中在对凝血酶的检测上。利用适配体对凝血酶的亲和力以及凝血酶的催化活性等特点,本文发展了新型的凝血酶联适配体法(TLAA)检测其他蛋白质,拓展了凝血酶及其适配体的分析应用。构建了一条由蛋白质目标分子适配体序列和凝血酶的适配序列体组成的DNA探针,DNA探针既可与蛋白质目标分子结合,也可与凝血酶结合,通过凝血酶和适配体的直接结合将凝血酶分子标记在蛋白质上,从而将蛋白质的检测转化为凝血酶的检测。凝血酶催化底物产生光学信号,实现对蛋白质的定量测定。以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的检测为例,分别建立了几种不同模式的TLAA检测方法,包括三明治夹心模式的TLAA,滚环扩增偶联的TLAA和竞争模式的TLAA。整个论文包括如下6个章节:第一章:简要介绍了适配体的筛选和特点,综述了基于适配体的蛋白质检测方法,阐述了论文的立题背景、主要研究内容和创新点。第二章:发展了一种以磁球为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。DNA探针(由PDGF-BB的适配体、凝血酶的适配体和连接臂三部分组成)和包被在磁球上的抗体分别与PDGF-BB的两个位点结合,形成三明治结构,凝血酶与DNA探针中凝血酶适配体部分结合从而标记在三明治复合物上,凝血酶催化荧光底物或生色底物,产生可检测信号的产物,实现定量测定PDGF-BB。磁球的预富集作用和凝血酶的催化放大使该方法有较高的灵敏度,使用荧光底物时,检出限为16 pM。使用生色底物可以进行简单常见的吸光度分析,同时由于产物有颜色,可以利用反应前后溶液颜色的变化进行目测,实现对PDGF-BB的半定量检测。第三章:发展了一种以微孔板为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。在上一章工作的基础上,本论文以微孔板为固体基质,利用其快速高通量检测的优点,将抗体修饰在微孔板上,随后依次在微孔板中加入PDGF-BB和DNA探针,形成三明治结构。然后凝血酶被DNA探针捕获,标记在复合物上。凝血酶催化荧光多肽底物产生荧光信号,信号的强度与PDGF-BB的浓度在一定范围内呈线性相关。该方法也可用于复杂样品中PDGF-BB的检测。第四章:发展了滚环扩增偶联的凝血酶联适配体检测方法(RCA-coupled TLAA)。方法利用RCA反应产生具有重复凝血酶适配体序列的寡核苷酸,从而实现多重的凝血酶标记,而凝血酶的催化功能则将检测信号放大,实现了RCA和凝血酶催化的双重放大效应,进一步提高了检测灵敏度。修饰在微孔板上的抗体、PDGF-BB和连有引物的适配体形成三明治结构,引物与编码有凝血酶适配体互补序列的模板杂交,RCA反应将引物序列延伸,产生一条含有多重凝血酶适配体的长DNA链,RCA产物可以捕获许多凝血酶分子,在三明治复合物中实现多重的凝血酶标记。凝血酶催化其生色底物或荧光底物产生可检测的产物,实现对目标蛋白质的定量测定。由于RCA和凝血酶催化的双重放大效应,检测的灵敏度得到提高,在使用荧光底物的情况下,方法的检出限可低至3.1 pM,与单个凝血酶分子标记相比,检出限降低了62倍。第五章:构建了竞争模式的TLAA检测体系。首先PDGF-BB吸附在微孔板表面,然后溶液中的PDGF-BB和固定在微孔板上的PDGF-BB竞争性地与一条包含PDGF-BB适配体和凝血酶适配体的DNA探针结合,与固定的PDGF-BB结合的DNA探针捕获凝血酶分子,最后捕获的凝血酶催化底物产生荧光信号,进而完成对溶液中PDGF-BB的定量检测。溶液中的PDGF-BB越多,与固定的PDGF-BB结合的凝血酶就越少,从而引起荧光信号的下降。方法可以检测0.125 nM的PDGF-BB,同时实现在1%人血清的检测。与三明治检测模式相比,竞争模式的TLAA只需要一个亲和探针,缩短了实验时间。通过简单改变DNA探针中适配体序列,该方法可以凝血酶为标记用于其它物质的检测,扩大了检测物范围。第六章:总结了本文的主要工作和创新点,提出了下一步的工作计划。