目的:根据最新统计结果,我国结直肠癌发病率为28.20人/10万人,位居所有癌症第3位。死亡率为13.61人/10万人,位居所有癌症的第五位。尽管目前随着诊疗技术的突破,包括化疗在内的多种治疗方式显著延长了结直肠癌患者的生存,但是传统化疗方案仍然存在着例如治疗效率低,靶向性差等诸多问题。因此,开发新的治疗方式以及研发新型药物递送载体在增敏药物药效的同时实现药物的靶向递送具有着重大意义。近年来,研究人员通过构建能够搭载各类治疗药物的纳米载体,增强了化疗药物对肿瘤细胞的敏感性。虽然纳米载体搭载化疗药物可以实现化疗药物的肿瘤靶向递送及化疗增敏的效果,但是在实际应用中纳米载体仍然存在许多问题,如较差的生物相容性所引起的毒副作用等。因此,如何构建合适的纳米药物递送体系是一项重大挑战。近年来,小分子化疗药物的共组装体系引人关注,该类载体因具有分子结构简单,易于制备等优势,成为药物递送领域的研究热点。在这之中,短肽纳米材料因其能够形成多种纳米结构（如球形纳米胶束、管状纳米纤维等）,且具有良好的生物相容性成为了研究热门。其中苯丙氨酸二肽（PHE）在具有良好的生物相容性的同时也可以与其他小分子化疗药物在水相溶液中共组装成纳米药物。光动力治疗（PDT）能够通过光敏剂产生单线态氧对肿瘤进行杀伤。目前,尽管光动力治疗的研究进展迅速,但是该疗法的临床转化遇到了一些问题。第一,对于结肠癌这类深部脏器肿瘤,经皮光照对纳米粒进行激发效率低下。第二,由于大部分光敏剂的递送效率偏低,进而造成光敏剂在肿瘤部位富集不良,导致PDT的疗效不佳。目前已有研究研发出结肠镜辅助下,肠道内直接对肿瘤病灶进行光照以激发纳米粒进行PDT治疗的技术,提高了纳米粒的激发效率。因此,如何构建合适的纳米载体靶向递送光敏剂至肿瘤部位进行PDT成为了提高PDT对结肠癌的疗效的关键。综上所述,考虑到传统治疗手段,特别是化疗的局限性,我们探索了光动力治疗在结肠癌治疗中的应用。为了更好地促进PDT的临床转化,我们选用了光敏剂焦脱镁叶绿酸a（PPA）,这一已被深入研究的光敏剂作为研究药物。我们利用苯丙氨酸二肽和PPA共组装形成纳米粒,解决了PPA的生物相容性不佳的问题,提高了PPA的外周循环时间及PPA在肿瘤内的富集含量,进而增强了PPA的抗肿瘤疗效及抗肿瘤免疫激活作用。研究方法:1、我们首先通过反溶剂沉淀法顺次加入相应化合物制得PPA与苯丙氨酸二肽共组装纳米粒（PPA@PHE）。随后利用粒径仪对纳米粒的粒径及电位进行检测以初步验证纳米粒合成成功。通过透射电镜（TEM）证实粒子合成成功并表征纳米粒的基本形貌。2、我们通过分子对接及分子动力学模拟了PPA与苯丙氨酸二肽在水相溶液中的相互作用,分析了PPA与苯丙氨酸二肽的相互作用方式。随后通过每日监测PPA@PHE纳米粒的粒径变化,检测PPA@PHE纳米粒的稳定性。3、我们通过检测PPA@PHE纳米粒的全波长激发和发射波谱,证实PPA@PHE纳米粒中PPA的特征峰的存在。随后在体外水平通过共聚焦及流式细胞学检测CT26细胞对PPA@PHE纳米粒的摄取,并通过CCK-8实验检测PPA@PHE纳米粒对CT26细胞的杀伤,以说明纳米粒对结肠癌细胞的杀伤能力,初步证实PPA@PHE纳米粒的抗肿瘤活性。体外构建CT26结肠癌细胞的肿瘤球模型,通过肿瘤球渗透实验验证PPA@PHE纳米粒的肿瘤渗透能力。4、构建CT26结肠癌细胞荷瘤Balb/c小鼠模型,检测PPA@PHE纳米粒在荷瘤小鼠体内的组织分布及外周循环情况,证实PPA@PHE纳米粒具有良好的外周循环能力并能够富集在肿瘤组织中。5、构建CT26结肠癌细胞荷瘤Balb/c小鼠模型,进行药效学实验,通过检测小鼠肿瘤体积,肿瘤质量等指标,证实PPA@PHE纳米粒的抗肿瘤活性。6、将小鼠各脏器石蜡包埋,切片并HE染色,观察各组小鼠的心,肝,脾,肺,肾以及肿瘤组织的病变及坏死情况,结合小鼠体重以及小鼠肝肾功等安全性指标,说明PPA@PHE纳米粒的安全性。7、免疫荧光染色肿瘤组织切片以定性检测各组小鼠的肿瘤内的CD4+和CD8+T细胞的含量。通过Elisa实验检测肿瘤组织内炎性因子含量,证实PPA@PHE纳米粒对肿瘤微环境的改善。8、通过流式细胞学检测接受不同治疗的小鼠的脾脏及肿瘤组织内的DC细胞,CD8+T细胞及调节性T细胞含量,以说明PPA@PHE纳米粒诱导抗肿瘤免疫的能力。9、通过分子对接及分子动力学,预测了PPA@PHE纳米粒入胞后与蛋白的相互作用方式。结果:1、我们首先通过反溶剂沉淀法制备得到PPA@PHE纳米粒,其粒径大小为70.419±5.519 nm,PDI为0.125±0.007。粒子电位呈负电,电势为-16.1±2.81 m V。粒子稳定性结果显示,PPA@PHE纳米粒在体外的稳定性良好,至第7天时,PPA@PHE纳米粒粒径较第0天无明显变化。2、分子对接结果显示,PPA@PHE纳米粒在水相溶液中稳定,PPA与苯丙氨酸二肽结合后整体能量稳定,未见明确分散,结合指数为-3.116 kcal/mol。3、对PPA@PHE纳米粒和游离PPA溶液的激发和发射波谱进行扫描,结果显示PPA@PHE纳米粒具有PPA的特征性激发和发射峰。说明PPA与苯丙氨酸二肽的共组装过程不会影响PPA的光敏活性。4、检测小鼠结肠癌CT26细胞对PPA@PHE纳米粒的摄取。共聚焦结果显示,与游离PPA相比,CT26细胞对PPA@PHE纳米粒的摄取量更大。荧光定量结果显示,PPA@PHE纳米粒与细胞孵育2小时,4小时和8小时后,纳米粒被细胞摄取的量逐渐增高,且在相同时间点,细胞对PPA@PHE纳米粒的摄取量大于对游离PPA的摄取量。流式细胞学结果证实,与游离PPA相比,更多的细胞摄取了PPA@PHE纳米粒。CCK-8结果显示,PPA@PHE纳米粒较游离PPA溶液对CT26细胞具有更强的杀伤能力,而苯丙氨酸二肽并不会对肿瘤细胞造成杀伤。5、构建3D肿瘤球模型,检测PPA@PHE纳米粒和游离PPA的肿瘤渗透能力。结果显示PPA@PHE纳米粒在距离肿瘤顶端50μm,100μm和150μm处均渗透至肿瘤球内部,而游离PPA仅能够渗透至肿瘤球外层。6、进一步检测了PPA@PHE纳米粒及游离PPA溶液在外周血的药代动力学,结果显示较游离PPA,PPA@PHE纳米粒具有更好的外周循环能力。7、进一步检测PPA@PHE纳米粒及游离PPA溶液在体内的组织分布。结果显示与游离PPA溶液相比,PPA@PHE纳米粒肿瘤富集能力更强。给药3小时后,游离PPA组肿瘤组织中未见荧光富集,仅在肝脏处可见少量荧光富集。与游离PPA组相反,给药后24小时内,PPA@PHE纳米粒组肿瘤组织中可见制剂荧光的富集。8、以鼠源结肠癌（CT26）荷瘤Bal B/c小鼠为动物模型,进行体内水平的药效学研究。结果显示,给予小鼠PBS或苯丙氨酸二肽治疗不会产生肿瘤抑制作用,小鼠的肿瘤持续快速增长。在给药后第12天,PBS组小鼠的肿瘤体积达到1200 mm~3,而苯丙氨酸二肽组的小鼠肿瘤体积也达到了1100mm~3。统计分析结果显示两组肿瘤增长曲线无统计学差异。游离PPA溶液展现了一定的抗肿瘤能力。在给药后第12天,PPA溶液组肿瘤大小维持在600mm~3,肿瘤抑制率为46.50%。PPA@PHE共组装纳米粒组则表现出最佳的抗肿瘤活性,在给药12天后,肿瘤体积维持在300 mm~3以下,肿瘤抑制率为82.09%。9、随后进一步检测各组制剂的安全性,同接受PBS治疗的小鼠相比,各组小鼠在接受3次治疗的时间内均未发生明显的体重下降。且接受治疗后各组小鼠的器官指数与PBS组无明显差异。取治疗后小鼠的心肝脾肺肾等重要器官进行HE染色,结果显示各个脏器未见明确损伤。接受治疗后小鼠的外周血肝肾功等血生化指标也未见明显异常。这些结果证实了PPA@PHE纳米粒具有较好的安全性。10、免疫荧光结果显示,肿瘤经PPA@PHE纳米粒治疗后,肿瘤内的CD8+T细胞含量明显增加,说明了PPA@PHE纳米粒具有着良好的抗肿瘤免疫激活作用。Elisa结果显示,PPA@PHE纳米粒治疗后肿瘤组织中的TNF-α的浓度分别是游离PPA组、苯丙氨酸二肽组及PBS组的1.66倍、2.70倍以及2.96倍。IL-6的浓度分别是游离PPA组、苯丙氨酸二肽组及PBS组的1.83倍、3.82倍以及3.36倍。说明PPA@PHE纳米粒能够引起肿瘤组织的炎性反应,进而改善肿瘤微环境。11、利用流式细胞学检测各组小鼠的肿瘤和脾脏的CD8+T淋巴细胞,DC细胞和调节性T细胞（Treg）的含量。结果显示,PPA@PHE组的肿瘤组织和脾脏中的CD8+T淋巴细胞和DC细胞的含量多余其他各组,证实PPA@PHE纳米粒治疗后产生了较强的抗肿瘤免疫。同时PPA@PHE纳米粒组肿瘤组织的Treg细胞含量少于其他各组,说明肿瘤经过PPA@PHE纳米粒治疗后,肿瘤的免疫抑制微环境被缓解。12、通过分子对接及分子动力学实验,我们发现PPA@PHE纳米粒入胞后可能能够与谷胱甘肽S转移酶（GST）相互作用。结论:我们发现,PPA可以与苯丙氨酸二肽通过反溶剂沉淀法共组装形成纳米粒,且稳定性良好。肿瘤细胞对PPA@PHE纳米粒具有良好的摄取能力。同时,PPA@PHE纳米粒也具有良好的肿瘤细胞杀伤能力和肿瘤渗透能力。更加重要的是PPA@PHE纳米粒较游离PPA溶液具有更好的生物相容性,因而PPA@PHE纳米粒具有更佳的外周循环能力和肿瘤富集能力,并能够在体内水平上显示出更好的抗肿瘤活性和抗肿瘤免疫激活能力。