放射性肺损伤是肺癌、乳腺癌等胸部肿瘤放射治疗常见的并发症,也是核与辐射事故大剂量照射人员常见的病理损伤,是严重影响患者放疗效果及生存质量的主要原因之一。随着我国人口老龄化、生活环境恶化、不良生活行为习惯、食品安全问题等公共卫生问题日益增多导致肿瘤发生率不断上升。根据IARC预测,我国癌症发病人数与死亡人数到2020年将分别升至400万与300万人左右;而到下一个十年这一数字分别上升为500万与350万。放射治疗仍然是当前诸多胸部肿瘤主要的治疗手段,需要胸部放疗的肿瘤患者将逐年增多,虽然当今临床上已采用多维适形调强放射治疗(IMRT)、缩小受照视野等先进的放疗技术与手段,但放射性肺损伤的发生率仍居高不下,严重影响胸部肿瘤患者的放疗效果。现较为统一的观点将放射性肺损伤病理划分为两个时期:即发生在早期放疗后数周的放射性肺炎表现及后期发生在数月的放射性肺纤维化病变。由于放射性肺损伤的发病机理的较为复杂,其发生机制目前尚未完全阐明。有众多研究表明电离辐射导致机体氧化损伤、众多细胞因子异常表达及基质金属蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)在肺组织中高表达导致的肺组织中基底膜受到破坏被认为与放射性肺损伤有密切联系。目前临床治疗放射性肺损伤通常采用糖皮质激素等抗炎药物、SOD制剂等抗氧化制剂、IFN-γ等细胞因子疗法。这些疗法虽然在一定程度上取得一定疗效,对早期肺部炎症反应有一定的缓解作用,但对于发生在后期的肺纤维化病变并没有显著的治疗效果。加上这些疗法存在包括感染、呕吐,甚至导致死亡的严重毒副作用风险,直接限制了其在临床中的应用。临床中迄今尚无有效防治放射性肺损伤的药物,因此开发高效、低毒、经济的防治放射肺损伤的药物是非常紧迫的。植物提取物在亚欧地区医学体系中占有重要地位,因其天然植物提取物具有毒副作用小及较为广泛的药理学作用,普遍应用于各类疾病中。已有大量研究证实植物提取物能够有效减轻电离辐射损伤,其中有不少关于减轻放射性肺损伤的研究报道。因此,在寻找防治放射性肺损伤药物方面,植物提取物可能是未来重要的药物来源之一。标准桃金娘油(Myrtol Stan.)是由桃金娘科属[Rhodomyrtustomentosa(Ait.)HASSK.]植物中提取的标准挥发油物质,主要由1-8按叶素、α-派蒎、柠檬蒎三大类单萜构成(本文所指桃金娘油即为标准桃金娘油)其药理学作用包括抗炎、抗感染、抗变态反应等。桃金娘油以其良好的安全性及疗效的确切性,现已普遍应用于各类呼吸道疾病当中,并取得了较好的防治效果,桃金娘油具有较强的安全性,急性毒性少见,人的最大可耐受剂量达1500mg/kg,在大鼠中超过2000mg/kg,即使在3500mg/kg的剂量情况下,也未观察到明显的毒副反应,长期持续使用桃金娘油没有观察到到明显的毒副作用。结合桃金娘油的诸多优势与放射性肺损伤相关发病机制理论,我们认为桃金娘油在放射性肺损伤中可能发挥重要的防治作用。关于桃金娘油在放射性肺损伤防治方面研究目前未见相关文献报道。本课题将重点探讨标准桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用及其可能机制。为临床放射性肺损伤防治提供新的依据与思路。研究主要内容:1、建立放射性肺损伤小鼠模型选用c57bl/6小鼠,给予单次大剂量全胸照射,照后不同时间进行病理观察及上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)相关标志物观察,建立小鼠放射性肺损伤模型。2、桃金娘油对小鼠放射性肺损伤的防治作用以第一部分已建立的c57bl/6小鼠放射性肺损伤模型为研究对象,采用照前、照后均给予桃金娘油,观察桃金娘油对小鼠的肺大体、肺系数、肺病理变化、肺上皮间质转化标志物改变、羟脯氨酸含量的影响,并与目前临床上常用的糖皮质激素强的松作为阳性药物比较,分析桃金娘油对小鼠放射性肺损伤的防治效果。3、桃金娘油对放射性肺损伤防治机制的初步探究从相关细胞因子及其mrna水平的调控作用,基质金属蛋白酶mmp-2/-9的表达变化,及抗氧化能力等方面探究桃金娘油对放射性肺损伤防治的可能作用机制。实验研究方法:第一部分:小鼠放射性肺损伤模型的建立1、6-8周龄雌性c57bl/6小鼠,麻醉后固定于自行设计的pe盒中,以铅砖选择性阻挡射线,单次行大剂量16gy60coγ射线全胸照射。2、小鼠受照后1,2,4,8,16周取肺组织行病理学观察(h&e、masson染色)。3、使用包埋的肺组织蜡块行免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)、波形蛋白(vimentin)表达。第二部分:桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用1、动物分组与给药:将购回小鼠分为4组,正常对照组(n=30);单纯照射组(n=30);桃金娘油+照射组(n=30,25mg/kg/day);强的松+照射组(n=30,5mg/kg/day)。桃金娘油+照射组小鼠照前使用灌胃给药一周,剂量为25mg/kg·day,进行全胸照射造模后继续给药4周,强的松+照射组在受照进行给药。各组于照后1,2,4,8,16周取肺组织进行观察分析。2、观察各组小鼠体重、肺湿重变化,计算小鼠肺系数;同时观察小鼠肺大体变化情况。3、对各组小鼠肺组织进行h&e与masson染色,观察小鼠肺病理变化,并进行半定量分析。4、使用免疫荧光检测vimentin、α-sma在小鼠肺组织中表达;westernblot检测肺组织上皮标志物e-钙粘素(e-cadherin)变化,以了解小鼠肺组织上皮间质转化情况。5、使用碱水解法检测小鼠肺组织中羟脯氨酸(hyp)的含量,了解各组小鼠胶原沉积状况即肺纤维化程度。第三部分:桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用机制的初步探究1、小鼠称重后,使用心脏取血500μl,静置1.5h-2h,3500r/min4℃离心取血清,用elsia试剂盒检测小鼠血清中白介素-1β(il-1β)、白介素-6(il-6)、转化生长因子β1(tgf-β1)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、前列腺素e2(pge2)。使用rt-pcr对相关细胞因子的基因转录水平进行检测,分析il-1β、il-6、tgf-β1、tnf-α、pgesmrna表达水平变化。2、使用wb检测放射性肺损伤小鼠肺组织中atk/p-akt、mmp-2/-9蛋白的表达。3、使用mda/sod试剂盒检测小鼠肺组织mda含量及sod活力,了解小鼠氧化损伤状况。实验结果:1、放射性肺损伤小鼠模型的建立c57bl/6小鼠经单次16gyγ射线全胸照射后,与正常组小鼠相比,初期肺部炎性浸润严重,后期肺间质形成弥漫性肺纤维化,肺结构破坏,而且间质标志物α-sma、vimentin表达均增高,与报道的小鼠放射性肺损伤模型基本一致。表明建立的小鼠放射性肺损伤模型是成功的。2、桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用(1)小鼠受照后体重出现下降,肺水肿、出血严重,导致肺系数上升。而桃金娘油能够明显改善照后小鼠肺水肿程度,减轻小鼠体重下降水平,在受照后2,4,8,16周,桃金娘油+照射组小鼠肺系数不但均显著低于单纯照射组(p<0.05或p<0.01),而且优于阳性对照药强的松对小鼠肺系数的影响。(2)小鼠受照后1、2、4、8、16周,h&e染色结果显示,受照后1、2、4周单纯照射组出现较为严重的炎症浸润,桃金娘油能够很好地改善由电离辐射诱导的肺组织炎性表现,通过对h&e染色病理切片进行肺泡炎评分,相比单纯照射组肺泡炎程度有显著差别(p<0.05或p<0.01)。masson染色结果显示,桃金娘油能够有效减轻早期炎症表现及后期的肺纤维化病变,通过半定量评分发现桃金娘油+照射组相比单纯照射组可显著减轻放射性肺损伤后期肺间质增厚的肺纤维化病理改变(p<0.05或p<0.01),肺纤维化程度明显改善。强的松虽在早期能够减轻小鼠肺部炎性反应,但对小鼠后期肺纤维化病变并没有显著的作用。(3)小鼠受照后8、16周,与单纯照射组相比,桃金娘油+照射组间质标志物vimentin、α-sma表达均明显下调,而上皮标志物e-cadherin表达均明显上调,强的松+照射组可见轻度下调vimentin、α-sma表达,上调e-cadherin,但效果不及桃金娘油处理组。(4)相比单纯照射组,桃金娘油+照射组hyp含量明显减少(p<0.05或p<0.01),提示桃金娘油能够有效减少肺组织中胶原纤维沉淀而强的松在后期对hyp含量的抑制作用不如桃金娘油(p<0.05或p<0.01),可见强的松对后期小鼠肺纤维化的治疗作用并不明显。3、桃金娘油对放射性肺损伤防治作用机制研究(1)桃金娘油能够有效下调小鼠血清中il-1β、il-6、tgf-β1、tnf-α、pge2的表达(p<0.05或p<0.01),其mrna水平也得到不同程度的抑制(p<0.05或p<0.01)。而强的松虽在早期对il-1β、il-6、tnf-α等前炎性因子及其mrna转录水平有一定的抑制作用,但是对tgf-β1及其mrna水平没有明显作用,反而加速促纤维化因子的分泌。(2)桃金娘油能够有效抑制akt及其活化形式p-akt的表达,从而下调小鼠肺组织中mmp-2/-9的高表达。(3)小鼠受照后可导致机体脂质过氧化物mda含量上升,而桃金娘油能够有效抑制电离辐射导致的过量脂质过氧化物mda的生成(p<0.05或p<0.01),并且能够提高后期小鼠机体的sod活力(p<0.05或p<0.01),维持机体抗氧化水平。讨论分析:放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗常见的并发症。我们通过观察小鼠体重、肺系数、肺病理、相关上皮间质转化标志物及羟脯氨酸含量等方面变化情况集中探讨了桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用。结果显示,桃金娘油能够显著减轻放射性肺损伤程度,包括早期的放射性肺炎及后期的放射性肺纤维化。电离辐射导致的多种炎性因子代谢失调、基质金属蛋白酶的高表达及氧化损伤可能是放射性肺损伤发生的主要原因。本实验发现桃金娘油能够显著抑制血清中一系列炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2及促纤维化因子TGF-β1高表达,其mRNA水平也得到不同程度的抑制,有效改善肺部炎性反应及后期的肺纤维化病变。MMP-2/-9的高表达可导致肺结构破坏,是引起肺部炎性反应及胶原沉淀的重要病理机制。我们研究发现,桃金娘油可能通过阻滞AKT通路的活化而下调MMP-2/-9的表达,从而减轻肺损伤程度。此外,我们还发现桃金娘油能够明显减少脂质过氧化物MDA的生成,上调SOD活力,增强小鼠机体抗氧化能力,减轻电离辐射导致的氧化损伤程度。而强的松虽能够缓解早期炎性反应,但对后期的肺纤维化并没有明显作用,反而出现体重下降、骨质疏松、并发感染等诸多不良副作用。结论:桃金娘油在放射性肺损伤防治中显示出较强的抗炎、抗氧化、抗纤维化的作用,对小鼠放射性肺损伤具有较好的防治作用,这一功效可能是通过抑制炎症因子及促纤维化因子生成,阻滞AKT通路而下调基质金属蛋白酶-2/-9的表达,提高机体的抗氧化能力而发挥作用。桃金娘油未来有望在临床实践中发挥作用,具体详尽的抗炎抗纤维化机制需要进一步深入研究。