草鱼是我国重要的淡水养殖鱼类,由嗜水气单胞菌引发的草鱼运动气单胞菌败血症(又称细菌性败血症)一直是制约草鱼养殖业发展的重要疾病。我们评价了池塘养殖草鱼的健康水平,检测了草鱼各项免疫指标,测定了感染草鱼脾脏基因组DNA甲基化水平,旨在探究致病性嗜水气单胞菌感染草鱼的免疫机制,为草鱼抗病育种提供理论依据。本研究的工作如下:1.养殖草鱼健康状况评估采用血液学、血清学分析方法,结合组织病理学技术对草鱼进行健康状况评估。血液学分析采用红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞容积(MCV)和白细胞分类计数(DLC)(白细胞分类计数:单核细胞百分比、嗜中性粒细胞百分比、血栓细胞百分比、淋巴细胞百分比);血清学分析主要包括谷丙转氨酶(ALT)活性、谷草转氨酶(AST)活性、溶菌酶(LYZ)活性、过氧化物酶(POD)活性、补体C3、C4定量和免疫球蛋白M(IgM)定量;组织学检查包括取鳃、肝脏、体肾、肠道制作石蜡切片并结合HE染色的方法,结果显示:试验草鱼白细胞计数值高于标准值的10倍,嗜中性粒细胞比例低于参考,血栓细胞比例偏高;血清ALT和AST值偏低,免疫球蛋白M定量高于参考值;组织病理学检查鳃、肝脏organ index高,histological index为21-40(Class III-Class IV),而肾脏和肠道organ index低且病变程度未见超过Class II,表明实验草鱼机体出现了可能由水质变化或营养代谢异常而导致的鳃病变及肝功能损伤,实验草鱼均未发现病原菌感染。2.感染嗜水气单胞菌草鱼免疫指标测定在确定草鱼体质健康的情况下,我们对草鱼进行嗜水气单胞菌感染实验。之前通过预实验确定嗜水气单胞菌半致死浓度为107cfu/ml。感染组草鱼肌肉注射100μl经二次活化后的嗜水气单胞菌,对照组注射等量PBS溶液,分别经0、1、3、7、14、21天取血液分析,每个时间点对照组、感染组各取3尾鱼,分别测定血液中RBC、WBC、HCT、MCV和DLC和血清中总蛋白(TP)、溶菌酶(LYZ)、过氧化物酶(POD)、免疫球蛋白M(IgM)和总补体(ACH50),每尾鱼每个指标测定3次。结果显示:感染组白细胞计数显著高于对照组,单核细胞、嗜中性粒细胞百分比在感染后第1天显著高于对照组;血栓细胞在感染后7-21天先上升后下降,与对照组相比差异极显著;淋巴细胞在7-21天先下降后上升,与对照组相比差异显著。血清学分析显示,在感染1-3天,感染组总蛋白水平较对照组显著上升;溶菌酶活性在1-7天表现为先上升后下降,差异显著;感染草鱼过氧化物酶活力在第1天显著下降;IgM和ACH50定量分别在感染7天、21天显著上升。结果表明:草鱼对嗜水气单胞菌的感染分别在1-3、7-21天出现强烈的免疫反应,而免疫球蛋白M的上升表明此时后天免疫开始发挥作用,表明感染第3-7天为发病高峰期。3.感染嗜水气单胞菌草鱼基因组DNA甲基化研究我们用半致死浓度嗜水气单胞菌感染草鱼,分别在0、12h、24h、48h、72h取脾脏,提取基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳检测合格后,用于基因组DNA甲基化水平(5-mc%)检测。发现72h基因组DNA甲基化水平显著高于0h,将0h和72h脾脏基因组DNA进行高通量测序分析,结果发现0h和72h同一覆盖度的同种位点差异不大,CG位点随着覆盖度的增加甲基化比例也逐渐升高,CHG和CHH比例逐渐降低。本次测序4个脾脏DNA样品两两比较,在genebody统计到974和1010个差异表达基因,在TSS附近统计到1812和2011个差异甲基化基因。GO功能分类中共有693个差异表达基因参与1122个GO功能条目;通路结果表明在127个pathway中共有236个差异表达基因参与,其中也包括同一基因参与不同通路的情况。我们发现甲基化上调显著的ABC转运器通路、泛素水解蛋白途径、范可尼贫血通路、P53信号通路、mTOR信号通路与疾病发生相关;此外,赖氨酸降解途径、细胞粘附分子途径发生甲基化下调。推测这些途径在感染草鱼的抗病过程中发挥直接或间接的作用。