论文部分内容阅读
N6-甲基腺苷(m~6A)是发生在腺苷N6位的甲基化,这是真核m RNA上最普遍的内部修饰。而METTL3作为m~6A甲基化转移酶的核心成分,介导m~6A甲基化的“写入”过程,已被证实在多种癌症中发挥着致癌或者抑癌的作用。可谓METTL3之于癌症是一把双刃剑。而结肠癌作为十大恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。虽然目前采用手术,化疗以及分子靶向治疗的方法提高了患者治疗效果,但全球每年仍增加超过100万新病例以及大约60万人死亡。为了研究METTL3对人结肠癌HCT-116生物学特性的影响,通过CRISPER/Cas9基因编辑技术,构建METTL3敲低载体,转染结肠癌HCT-116细胞,有限稀释法筛选目的克隆,利用Western Blot筛选建立METTL3敲低细胞系。另外,通过构建METTL3基因过表达的慢病毒载体,将PLVSIN-METTL3、PLVSINEV载体与辅助质粒共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装。利用包装好的病毒感染结肠癌HCT-116细胞系,利用Western Blot筛选建立METTL3过表达细胞系。并通过实时定量PCR检测WT-HCT-116细胞系、KD-METTL3细胞系、PLV-METTL3细胞系以及PLV-EV细胞系这四种细胞系的基因表达水平。为了检测METTL3对HCT-116细胞行为学的影响,通过MTT细胞增殖实验发现,对于WT-HCT-116细胞系和KD-METTL3细胞系来说,KD-METTL3细胞系增值能力降低;对于PLV-METTL3细胞系以及PLV-EV细胞系来说,PLV-METTL3细胞系的增殖能力高,综合来说,过表达METTL3促进结肠癌HCT-116细胞增殖。为进一步研究METTL3对于细胞克隆形成能力的影响,采用细胞克隆形成实验,表明METTL3敲低后会抑制细胞的克隆形成。即METTL3下调后会抑制HCT-116细胞的克隆形成能力,也就是说HCT-116细胞的存活力降低。综上所述,METTL3表达下调,抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖能力和克隆形成能力,而上调METTL3,则会促进结肠癌HCT-116细胞的增殖,由此初步推断METTL3在人结肠癌HCT-116担任致癌基因的角色。