适配体作为新型生物识别分子,其研究及应用越来越受到研究者的关注。随着适配体研究及应用领域的不断深入,适配体的优势日益凸显,但同时也存在一定的问题亟待解决。适配体与真菌毒素的分子结合作用机制尚不完全明晰,限制了适配体的纵深发展。同时,由单一靶标识别向多靶标同时识别的适配体检测技术亟待开发。因此,为了给适配体分子探针的设计、筛选、构效关系等提供理论性指导,本研究以黄曲霉毒素B₁适配体为研究对象,采用序列剪裁优化、碱基突变替换等对适配体序列结构进行优化,结合等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）、荧光分析法深入研究“适配体-靶标”识别过程的分子基础,揭示适配体与靶标分子结合作用的分子机制,并基于理论基础进行应用研究的拓展。本课题围绕黄曲霉毒素核酸适配体的结合机制研究及应用,主要研究工作如下:1.黄曲霉毒素B₁适配体的剪裁优化。为了阐明AFB₁适配体的结合部位,易于后续修饰与结合机制研究,因此基于已报道的AFB₁的原始适配体,拟合其二级结构进行分析,对序列进行剪裁优化。通过软件Mfold对AFB₁适配体的二级结构进行分析,综合考虑适配体的作用结构和稳定性等因素,在保留茎环结构的基础上,对其进行适当的剪裁优化。通过ITC实验、荧光分析实验分别对剪裁优化适配体的亲和力和特异性进行验证,以确认剪裁优化是否有效。Apt-2作为有效的剪裁优化适配体中,碱基数量最短的一条,其Kd值、结合位点数、热力学参数均与原始适配体相近甚至更优,且对其他真菌毒素无结合作用,因此本剪裁优化实验中效果最优的适配体为Apt-2。2.黄曲霉毒素B₁与适配体结合机制研究。为了探究适配体与AFB₁的结合机制,基于上述获得的剪裁优化适配体Apt-2,根据二级结构中的“茎环”部分,设计碱基突变的位点。通过ITC实验、荧光分析实验分别进行亲和力验证,发现任何“环”部位的突变均会导致适配体亲和力的丧失,因此推测Apt-2是以整个“环”状部位为结合单元,去识别并捕获环境中的靶标,实现结合过程。为了明晰已报道的AFB₁适配体与AFB₁结构类似物也具有亲和性的原因,对AFB₁的分子结构组成物质和AFB₁的结构类似物进行ITC实验、荧光分析实验,探究AFB₁的结合部位。结果显示,AFB₁的结构类似物AFB₂、AFG₁、AFM₁通过ITC实验、荧光分析实验验证均具有与Apt-2的强结合能力。因此,AFB₁及其3种结构类似物与Apt-2结合的结构域是4种毒素共有的中心结构部位。推测AFB₁及其结构类似物分子在与Apt-2结合的过程中,暴露结构域,被Apt-2的“环”状部分识别从而进一步捕获实现结合。3.黄曲霉毒素适配体亲和柱的设计。基于上述研究发现,建立了一种基于适配体Apt-2对四种黄曲霉毒素（AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFM₁）的适配体亲和柱,用于样品前处理中的黄曲霉毒素的富集与净化。以链霉亲和素琼脂糖凝胶和生物素修饰的适配体按体积比1:2（适配体浓度为2μM）偶联获得偶联物为载体进行装填,组装成适配体亲和柱。适配体亲和柱在pH 7.4左右,温度25°C左右,有机物含量小于3%的条件下可发挥最大效能。在不超过8次使用次数时,适配体亲和柱的靶标结合率可维持在85%以上,同时适配体的亲和柱的单次最大柱容量为200 ng黄曲霉毒素。对于其他种属的真菌毒素,适配体亲和柱均不结合,呈现良好的特异性。此适配体亲和柱可用于实际样品中黄曲霉毒素的截留与富集,实现样品净化的目的。4.桥联适配体的设计。为了在适配体强特异性的优势基础上,开发多种靶标同时检测的桥联适配体,将获得的剪裁优化适配体Apt-2以小片段碱基序列作为桥联媒介,与赭曲霉毒素A（OTA）的适配体进行桥联,获得桥联适配体。通过桥联适配体的5’端和3’端荧光基团被淬灭导致荧光消失,与靶标结合后荧光恢复的过程表征桥联适配体有效。对四条桥联适配体进行ITC实验验证适配体的亲和力,基于解离常数、结合位点数、热力学参数等,最终确定以Poly A连接的QL-A作为桥联适配体的最优选择。通过等温滴定量热实验验证,发现QL-A不具有对其他真菌毒素的结合能力。桥联适配体QL-A,具有比单一适配体更低的Kd值,即亲和力得以提高,同时仍保持良好的特异性。