损伤组织可通过内源性基因转录调控改变多种细胞命运属性实现创伤的再生与修复。通过解析不同物种之间组织修复与再生的关键细胞、信号通路的激活以及基因转录调控,对促进和实现再生医学具有重要的意义。蜥蜴作为羊膜类脊椎动物,在进化上与哺乳动物及人类的关系更为密切。蜥蜴断尾和断肢代表羊膜类再生和疤痕形成的独特模式,适用于解析同一物种不同器官再生障碍和再生修复能力保持的细胞和分子机制。以我国特有卵胎生蜥蜴——秦岭滑蜥为研究对象,切割法建立断肢疤痕化愈合模型,记录断肢伤口愈合过程的大体解剖形态;利用常规组织学方法观察秦岭滑蜥断肢愈合过程的细胞构筑特征;采用免疫组织化学方法对瘢痕愈合相关蛋白的时空分布进行观察;基于断肢愈合阶段,选取再上皮化完成时间点做无参转录组分析,利用q RT-PCR对转录组结果进行验证;继而针对断尾和断肢再上皮化阶段开展比较转录组分析,结果如下:1.秦岭滑蜥断肢大体解剖形态观察结果显示:断肢后创面组织收缩,且出血量较多,随之1-2 dpw内凝结成痂,股骨突出,高于周围组织。7-9 dpw凝块消失,伤口愈合,被上皮完全覆盖。9-30 dpw断肢表皮逐渐变为灰色,形成0.5-1.0 mm的突起。40-100 dpw创面呈圆锥状隆起,鳞片形成,疤痕化愈合完成。2.基于组织形态学,秦岭滑蜥断肢愈合可大致分为止血、炎症、增殖和创面重塑四个时期,由五个阶段组成。阶段I,创伤后0-3 dpw,组织收缩,残断表面缩小,并且残端表面的受伤组织和截断的股骨被血凝块覆盖,其下方组织内浸润大量的造血细胞和白细胞。阶段II,3-9 dpw,完成上皮化,创面为2-3层细胞构成的伤口上皮所覆盖。在伤口上皮的下方的致密结缔组织中分布有大量的角质形成细胞和巨噬细胞丰富。阶段III,9-18 dpw,伤口上皮增厚,约由12层细胞组成;下层结缔组织中密布成纤维细胞,细胞间质明显;股骨周围聚集大量的侵蚀性破骨细胞。阶段IV,18-40 dpw,伤口上皮层变薄,约由6-7层细胞构成。伤口上皮下层的结缔组织中有胶原纤维分布,富含成纤维细胞。阶段V,40-100 dpw,伤口上皮仅由4-6层细胞构成,表层角质化且鳞片生成。软骨和伤口上皮之间为结缔组织填充,成纤维细胞和胶原纤维丰富,未见色素细胞分布。3.瘢痕愈合相关蛋白的免疫细胞化学定位结果显示:在伤口愈合的I-II阶段,断肢残端PCNA免疫阳性多于Caspase3阳性,表明残端增殖活跃。MMP-9阳性细胞存在于伤口上皮以及结缔组织的成纤维细胞中,对细胞外基质重塑具有重要作用。α?SMA在IV-V阶段肌成纤维中阳性显著,表明胶原形成参与瘢痕愈合。血管生成由VEGF和TSP-1调控,其免疫阳性在II-III阶段较强,血管生成活跃。第V阶段,VEGF和TSP-1免疫阳性仅在成纤维细胞中表达,表明血管退化,组织重塑。在断肢愈合的II-IV阶段具有Cytokeratin6阳性细胞,其仅在再上皮化完成后表达,参与表皮分化。4.秦岭滑蜥断肢再上皮化延迟,为揭示愈伤上皮对断肢愈合的影响,选取断肢9 dpw进行转录组测序分析。共获20826条注释结果,设置FDR＜0.01和FC≥2筛选差异表达基因,得到2557条DGEs,其中上调基因1175条,下调基因1382条。对DGEs进行GO功能注释和KEGG通路分析,发现差异上调基因主要集中免疫反应和炎症反应条目,参与细胞及其受体相互作用和Toll样受体信号通路。这表明受损肢体中普遍存在的上调基因促进炎症且诱导瘢痕形成相关免疫细胞增多。差异下调基因富集在Z盘和肌原纤维条目,参与钙信号通路和ECM受体相互作用通路,表明肌肉基因在被纤维细胞代替的瘢痕肢体中沉默。随机选取6个与炎症相关的基因cmklr1、csf-1r、cxc11、mmp-19、ccl4、tlr-2;以及2个与肌肉相关的基myom2、mylk4,共8个基因进行q RT-PCR的检测,其结果与转录组结果吻合。5.炎症反应参与断肢再生障碍和断尾再生修复能力保持调控,影响二者差异化形态建成。据此对断尾7 dpw和断肢9 dpw的转录组进行了比较分析,得到5137条DGEs,包括2353条差异上调基因和2784条差异下调基因,分别进行功能注释分析。上调基因主要富集在炎症反应,表明再上皮化后,断肢中存在强烈且持久的炎症反应。主要差异基因有:g-csf、il-36、il-8、il-20、irf、tnfrsf10、cmklr1、tagap、cd3e、cd96、siglec10等。表明炎症细胞、巨噬细胞、T细胞以及促炎因子的存在导致断肢仍处于炎症环境中。综上,秦岭滑蜥断肢后瘢痕愈合。PCNA、Caspase3、Cytokeratin6、MMP-9、α?SMA、VEGF和TSP-1在瘢痕愈合过程中具有不同的时空分布,参与断肢瘢痕愈合的形态建成过程。免疫调控在秦岭滑蜥断尾再生和断肢愈合差异化形态建成中发挥重要的调控作用。