硒是人体所必需的微量元素,具有抗癌作用能够诱导多种肿瘤细胞凋亡。大量研究表明:微量元素硒将成为抗肿瘤药物研究领域的一个研究热点。虽然对硒防癌治癌的作用已有报道,但是,对其机理并不十分清楚。本论文将在硒诱导白血病NB4细胞凋亡与自吞噬转换关系上进行研究,探究硒诱导白血病细胞凋亡的分子机理。自吞噬(Autophagy)是近年研究的一个热点课题。自吞噬是一个细胞将胞质中的老化蛋白或损伤的细胞器送入溶酶体内并将其降解的过程。在应激状态下,这些内容物被重新回收,为细胞提供能量,维持细胞稳态,促进细胞生存。然而过度的自吞噬可导致整个细胞功能的丧失,促进细胞死亡。本实验室前期研究结果表明,20μM亚硒酸钠能够有效抑制人急性早幼粒白血病NB4细胞的生长增殖并诱发细胞凋亡。基因芯片结果显示该凋亡的发生与线粒体和内质网信号通路相关。而目前已有研究表明自吞噬的发生可能与清除细胞内损伤的线粒体和内质网,促进细胞生存相关。并且,这两条信号通路中的蛋白是联系凋亡与自吞噬的关键调控蛋白。因此,本文诣从自吞噬与凋亡的关系入手,进一步研究亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的调控机制。从而为亚硒酸钠的临床应用提供有价值的理论依据。本文对亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中自吞噬与凋亡的关系进行了深入的研究。研究发现在NB4细胞中,自吞噬现象明显,随着亚硒酸钠作用时间的延长,自吞噬水平降低。发现PI3K-Akt信号通路促进了NB4细胞中的自吞噬水平,而自吞噬又促进了NB4细胞的生存。此外,研究还发现自吞噬的抑制剂和亚硒酸钠联用可提高NB4细胞的凋亡率。研究首先发现,在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,自吞噬被抑制。目前对自吞噬究竟是介导细胞生存还是死亡,结论并不一致。研究普遍认为不同的细胞株在不同药物作用下,结果不同。本研究通过电镜,流式细胞仪,丫啶橙染色,免疫印迹等方法充分证明,NB4细胞中的自吞噬现象明显,其相关基因Beclin1和LC3被高表达。而当用亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡时,细胞中自吞噬现象减弱,伴随凋亡率上升。采用自吞噬抑制剂进一步研究发现,在NB4细胞中抑制自吞噬可促进硒诱导的凋亡。采用自吞噬的抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)与巴佛洛酶素(bafilomycin A1,Baf A1)处理NB4细胞,发现其自吞噬现象减弱。3-MA可抑制自噬泡的形成,而Baf A1可通过抑制溶酶体上的质子泵阻止自噬泡和溶酶体的融合。单独使用3-MA并不能引起凋亡,但Baf A1可以。当我们将这两种自吞噬抑制剂与亚硒酸钠联用处理NB4细胞时,发现NB4细胞的凋亡率与单独被硒处理相比有很大幅度提升。进一步的机理研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路促进了自吞噬。本实验室前期研究证明抑制Akt的表达可促进亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡。因此我们在分子水平上分析了PI3K/Akt信号通路。经过亚硒酸钠处理的NB4细胞中,不论在有无自吞噬抑制剂存在的情况下,Akt的磷酸化水平都有显著下降。而且,硒可以抑制Akt下游蛋白mTOR底物p70S6K的磷酸化。更重要的是自吞噬的抑制剂可增强硒对p70S6K磷酸化的抑制程度,并且亚硒酸钠与自吞噬抑制剂联合处理比亚硒酸钠单独处理可更大程度上下调PI3K/Akt信号通路。证明了PI3K/Akt/mTOR信号通路在抑制NB4细胞自吞噬,促进凋亡过程中发挥重要作用。为进一步研究PI3K/Akt与自吞噬的关系,我们用PI3K的抑制剂LY294002处理NB4细胞,以探求Akt的抑制是否可以抑制自吞噬。结果发现抑制Akt的表达,可以抑制自吞噬。综上结果证明,亚硒酸钠可通过PI3K/Akt信号通路抑制NB4细胞的自吞噬促进细胞凋亡,并且抑制自吞噬可提高硒诱导NB4细胞的凋亡率。此研究为硒治疗白血病提供了新的理论依据。