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[目的]在纳米生物界面吸收和进行生物物理化学相互作用是一个巨大的挑战,同时也是近年来生物医学、纳米生物技术、化学和材料科学等研究领域的研究热点。抗菌肽,其功能之一可以编程执行特定的任务肽,并结合纳米颗粒被用作治疗的潜在方法之一。而人抗菌肽β防御素3(human β defensin 3,hBD3)作为抗菌肽的一种,具有抗菌和促进再生的特性。金纳米颗粒(goldnanoparticles,AuNPs)也在组织工程中表现出有前景的使用价值。然而,AuNPs和hBD3协同作用对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)及慢性牙周炎的作用研究较少。因此,本论文旨在探索炎性微环境下,hBD3及AuNPs协同作用对hPDLCs成骨分化作用及对治疗慢性牙周炎的影响。[方法]1.通过化学还原法制备45nm粒径的AuNPs。培养hPDLCs,加入大肠杆菌LPS(E.coli-LPS)(1 μg/mL)、hBD3(5μg/mL)和 AuNPs(10μM)。2.通过CCK-8法检测其对细胞活性的影响,从形态学观察其对细胞的作用。使用透射电子显微镜观察金纳米颗粒进入细胞的情况及对细胞的作用。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及定量观察、茜素红染色及活性测定观察hPDLCs成骨作用。采用Real-time PCR检测成骨相关基因ALP、Runx-2、I型胶原(Collagen I,COL-1)的表达、及Wnt/β-catenin 信号通路相关基因cyclin D1的表达,采用Western blot检测成骨相关蛋白ALP、Runx-2、COL-1及Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白 β-catenin 和 cyclin D1 的表达。加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001后,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及活性测定方法、Western blot、Real-time PCR等方法研究Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。3.结扎大鼠上颌第二磨牙建立牙周炎模型。实验组牙龈局部注射hBD3(5μg/mL)和AuNPs(10μM),对照组为未结扎组和结扎组,牙龈局部注射生理盐水。2周后处死大鼠,取上颌骨及血清,使用Micro-CT、HE染色、Masson染色、TRAP染色,及酶联接免疫吸附剂测定法(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-6及IFN-γ的表达,从而评估hBD3和AuNPs对牙周炎进展的作用。[结果]1.与对照组相比,E.coli-LPS、hBD3和AuNPs对hPDLCs活性均无明显影响;2.在E.coli-LPS刺激下,hBD3与AuNPs的协同作用能够显著增强ALP活性和矿化结节形成;定量分析结果也显示在E.coli-LPS刺激下,hBD3与AuNPs的协同作用所形成的ALP和矿化结节数量最多;Real-time PCR和western blot结果均表明在E.coli-LPS刺激下,hBD3与AuNPs的协同作用能够显著上调ALP、Runx-2和COL-1 mRNA和蛋白的表达,同时也能上调Wnt/β-catenin靶基因cyclin D1以及相关蛋白β-catenin和cyclin D1的表达。加入ICG-001后,cyclin D1基因及β-catenin和cyclin D1蛋白表达显著下降。此外,E.coli-LPS刺激下,hBD3与AuNPs协同作用组的ALP和矿化结节形成也被抑制,成骨相关基因ALP、COL-1和Runx2表达也被下调。3.在大鼠实验性牙周炎模型中,hBD3与AuNPs协同作用组能显著减少牙槽骨吸收。HE染色显示hBD3与AuNPs协同作用组能显著减少牙龈上皮棘层增厚、上皮钉突增生等病理变化。同时TRAP染色结果表明hBD3与AuNPs协同作用组能够显著抑制骨内破骨细胞数量。ELISA实验结果表明hBD3与AuNPs协同作用能够显著降低血清中TNF-α IL-6的表达,升高IFN-γ的表达。[结论]1.hBD3与AuNPs的协同作用对hPDLCs成骨分化具有促进作用,并可上调Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白的表达。ICG-001对于hBD3与AuNPs协同作用表达的β-catenin和cyclin D1表现出显著的抑制作用,同时也抑制hBD3与AuNPs的协同作用所促进的成骨相关基因ALP、COL-1和Runx-2基因的表达,表明hBD3与AuNPs促进hPDLCs成骨分化的过程是受到Wnt/β-catenin信号通路的调控。2.hBD3与AuNPs的协同作用能够减轻牙周组织炎症破坏程度,减缓牙周炎进展。