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百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV)是香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)中的一种,能够严重危害百合种球质量和鲜切花品质,是侵染百合的三大病毒之一。病毒为单链正义RNA,含有6个开放阅读框(ORF),编码4个蛋白,依5’至3’分别编码：RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),三基因连锁运动蛋白(TGB1-3),外壳蛋白(CP)和未知功能蛋白(16kDa)。本研究以感染LSV的百合叶片为试材,通过RT-PCR克隆LSV基因16kDa。将该基因连接至原核表达载体pET-28a(+),重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE及质谱分析,证明得到高效表达的16kDa融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在。经镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白。将纯化蛋白16kDa和TGB1分别作为抗原免疫小鼠,制备16kDa和TGB1蛋白抗血清,间接ELISA检测抗血清效价较高。通过Western blot分析,制备的特异性抗血清能与16kDa, TGB1以及百合叶片总蛋白反应,均出现目的杂交条带。制备的抗血清可用于病毒检测、蛋白质印迹、免疫组织化学等方面的研究。为了验证LSV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物RNA沉默,以16kDa和TGBl为研究对象,分别构建TGB1、16kDa和16kDa△的pMDTM18-T载体,测序正确后连至双元表达载体PTF101.1,将获得的重组质粒通过农杆菌共浸润到转GFP本氏烟16c。将TGB1、16kDa分别构建至双元表达载体pGR107,侵染普通本氏烟。结果表明：16kDa蛋白能抑制由GFP介导的局部沉默和系统沉默,其抑制作用较弱；能逆转系统沉默；不能抑制由dsRNA引起的局部沉默；TGB1蛋白无抑制沉默功能。实时定量PCR和Western blot也证明了上述结果,即16kDa是LSV编码的RNA沉默抑制子。另外,TGB1和16kDa均不能加重PVX病毒的症状,证明有些抑制子不会与PVX病毒协同作用。将含有PTT101-16kDa/TGB1质粒的农杆菌分别侵染烟草和百合,提取烟草和百合线粒体的总蛋白,Western blot检测证明16kDa和TGB1都位于线粒体上。免疫胶体金电镜观察发现16kDa和TGB1金颗粒在叶绿体中,但含量极少。以上结果表明：16kDa和TGB1主要作用于细胞线粒体中,对叶绿体影响有限。综上所述,本研究通过LSV编码蛋白TGB1和16kDa功能分析,初步判定16kDa蛋白具有RNA沉默抑制子功能。16kDa和TGB1主要定位在细胞线粒体上。因此可以推断,受百合无症病毒侵染植株外部症状不明显,无致病性,可能16kDa和TGB1蛋白主要受体不是叶绿体,而是线粒体。