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第一章GWAS新易感区域在多囊卵巢综合征家系中的研究背景:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一种存在高度遗传异质性的复杂性疾病。继第一期GWAS研究后,第二期GWAS研究发现了8个新易感区域。为了排除人群分层偏倚等因素的干扰,本研究对8个易感区域进行基于家系的关联性分析,以进一步验证前期GWAS发现的易感位点与该疾病的关联性。方法:共纳入321组核心家系(由先证者与其生物学父母组成,共计963例)为研究对象。应用Sequenom Mass Array对8个易感区域内最显著关联的10个SNPs进行基因型分析。然后对各SNP位点进行基于家系的传递不平衡检验(Transmission disequilibrium test,TDT)等。结果:经TDT分析,rs2349415位点的C等位基因(FSHR;TDTχ2=14.76,P=0.0001),rs3802457位点的C等位基因(C9orf3;TDTχ2=14.42,P=0.0001)以及rs2272046位点的T等位基因(HMGA2;TDTχ2=4.457,P=0.035),均存在显著的传递不平衡。rs4784165位点的T等位基因(TOX3;TDTχ2=3.846,P=0.050)表现出一定程度的传递不平衡。其他6个SNP位点虽然未到达统计学差异,但均存在过度传递现象。经多重检验校正后,rs2349415(FSHR;P=0.0036)和rs3802457(C9orf3;P=0.0046)依然存在显著的统计学差异。结论:rs2349415和rs3802457位点在PCOS家系发生明显的传递不平衡,该位点所对应的区域2p16.3和9q22.32确为PCOS的易感区域,其对应基因如FSHR和C9orf3在该疾病中的作用机制有待深入研究。第二章Micro RNA 601在多囊卵巢综合征发病中的作用机制研究背景:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)以稀发/无排卵、高雄激素和胰岛素抵抗为主要特征,在中国的发病率为5.6%,。鉴于该疾病的高度遗传异质性,本课题组先前利用GWAS技术报道了PCOS的11个易感区域,其中9q33.3区域是在不同人群中得到最广泛验证的,该区域所对应的候选基因为DENND1A,而在DENND1A近3’端的内含子区有一个micro RNA,名为MIR601(mi R-601)。目前为止,关于GWAS易感区域内非编码序列的研究非常少。因此本研究拟探讨mi R-601在PCOS患者中的表达特征及其在PCOS发病中的作用及其机制。方法:用q RT-PCR方法检测mi R-601在PCOS患者外周血及颗粒细胞中表达变化,并与临床指标进行关联分析。然后利用卵巢膜间质细胞和颗粒细胞体外单独培养的系统,研究mi R-601对甾体激素合成的影响,并结合生物信息学预测,用免疫共沉淀等技术,寻找mi R-601的靶基因,利用荧光素酶双报告基因系统进行验证。对验证的靶基因,通过体外细胞转染、激动剂/抑制剂等处理,用RT-PCR、Western blot等验证其靶基因的变化在介导激素合成中的作用。结果:mi R-601在PCOS患者血和颗粒细胞中表达均明显上调(P<0.01),且其表达分别与LH、T、E2以及AMH相关。体外实验证实SIRT1为mi R-601调控的靶基因,且SIRT1在PCOS患者外周血表达下降。mi R-601异常可通过其靶基因来调节激素合成相关基因的表达,使得卵巢膜间质细胞雄激素合成显著增加,对颗粒细胞雌激素影响不显著。SIRT1激动剂白藜芦醇可以使卵巢膜间质细胞雄激素合成减少,可拮抗mi RNA的作用。结论:源于PCOS GWAS易感区域的非编码序列mi R-601通过其靶基因如SIRT1促进雄激素合成,进而介导PCOS患者的高雄激素的发生。PCOS GWAS易感区域内的非编码序列在疾病中也发挥关键作用。第三章USP34基因与多囊卵巢综合征的相关性研究背景:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一种多因性疾病,遗传因素参与该疾病的发生。前期全基因组关联研究发现许多与疾病关联的位点,在基因USP34区域有一系列SNP因其P值接近但未达到GWAS严格的统计学要求而未被报道。本研究将选取该区域的SNP位点在独立于GWAS的样本中进行扩大验证。方法:纳入1218例PCOS患者和1057例对照,选取USP34基因区的2个SNP(rs17008097和rs17008940),用Taq Man-MGB探针法进行基因分型分析。结果:即使校正年龄和BMI,rs17008097和rs17008940的等位基因频率和基因型频率在病例和对照组之间没有显著的统计学差异。在PCOS患者中,按基因型分类分析临床和代谢指标(LH、T、HOMA-IR),未发现明显差异。但在PCOS组rs17008940与BMI有一定的关联,校正年龄后,这种关联也有统计学差异(TC vs CC P=0.006,OR=1.042,95%CI 1.012-1.073;TT vs CC P=0.037,OR=1.050,95%CI 1.003-1.100)。结论:USP34基因区的两个SNP位点(rs17008097和rs17008940)与中国汉族PCOS患者未发现显著性关联。