研究背景纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉淀的病理过程。我国每年有许多慢性肝炎患者最终发展为肝硬化。深入研究肝纤维化的发生机制,控制及逆转肝纤维化的进程具有重要的意义。目前普遍认为肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化形成初始的中心环节,并发现肝纤维化是可逆转的。HSC的激活包括两个步骤,即初始激活及持续激活。前者主要由旁分泌机制参与,而后者则既有旁分泌机制参与又有自分泌机制参与。HSC的激活与多种细胞因子密切相关,其中血小板衍生因子(PDGF)及其信号系统具有极强的刺激HSC活化与有丝分裂作用,PDGF及其信号系统也是抗肝纤维化治疗靶点之一。血管生成是指机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧或炎症等情况下,原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程。在肝纤维化进程中,除肝内炎症和ECM沉积外,还存在着血管增生及血管结构的重建,其中肝窦的毛细血管化会使其失去大量通透性极好的筛状排列的窗孔结构,影响肝细胞与血液之间进行活跃的物质交换,加重肝细胞供能及供氧障碍,促进肝脏纤维化发展。近年来国外多项研究表明肝纤维化与肝脏血管生成有一定相关性。有报道抗血管生成治疗可改善实验动物的肝纤维化；目前亦普遍认为肝脏的血管新生与纤维化的形成是相互需求、相互促进的。肝星状细胞与肝窦内皮细胞之间的相互作用也一直是肝纤维化研究的热点问题。外泌体(exosom e)是一类由多囊泡体或细胞膜产生的一类细胞外膜性小泡,其首要生物学功能是进行细胞间联络。外泌体含有细胞特异性蛋白分子、mRNA及miRNAs等重要分子,通过将这些分子送达靶细胞而发挥细胞间联络作用。近年来有研究探索了外泌体在肝脏炎症、纤维化和门脉高压发病机理中的潜在作用。亦有假设提出肝硬化患者中外泌体产生有增高。然而外泌体是如何在靶细胞发挥作用的机制未明,特别是在内皮细胞如何调控HSC迁移中的作用值得研究。卡维地洛是第三代非选择性β受体阻滞剂,兼有α1受体阻滞、抗氧化以及钙通道拮抗活性。有报道提示卡维地洛可减轻酒精或CCl4诱导的鼠肝纤维化,但其作用机制未见详细阐述。亦有报道提示其类似物普萘洛尔具有抗血管形成作用。总之,卡维地洛可能具有抗肝纤维化及血管形成的作用,但缺乏研究及证据。本研究首先观察卡维地洛对HSC激活是否有直接抑制作用,接着研究了卡维地洛对内皮细胞的功能影响。最后,我们研究了源于内皮细胞的外泌体对HSC的激活作用及其机制。总之,我们研究了内皮细胞与HSC相互作用促肝纤维化机制及药物治疗的意义。第一部分卡维地洛通过PDGFR/AKT抑制人肝星状细胞的增殖及活化目的以人肝星状细胞系(LX-2)为研究对象,通过体外实验研究卡维地洛对PDGF-BB诱导的HSC激活的影响,并进一步探讨其内在机制。方法1.CCK8检测细胞增殖水平按实验设计的分组(空白对照,阳性对照以及药物处理)情况,将细胞分入96-孔培养板培养。24h后进行CCK8分析,检测卡维地洛对HSCs增殖的影响。2.划痕实验检测细胞迁移能力按实验分组将细胞接种于6孔板中,200μL灭菌移液器枪头沿培养板划直线,加入PDGF-BB及浓度梯度的卡维地洛处理24h后图像采集。3.使用Transwell进行侵袭能力测试按实验分组将细胞接种于铺有基质胶的Transwell小室上室,同时加入不同浓度的卡维地洛,下室加入PDGF-BB。继续培养24小时后取出上室,剪下底部膜染色,光学显微镜下图像采集并计数。4.Real-time PCR和Western Blot检测卡维地洛对LX-2纤维化相关指标表达水平的影响。按实验分组将细胞接种于6孔板中,药物处理后提取细胞总RNA或蛋白,采用real-time PCR技术检测LX-2中Ⅰ型胶原(Col 1)和纤连蛋白(FN)的mRNA表达水平。Western Blot检测FN和α-SMA蛋白表达水平。5. Western Blot检测卡维地洛对LX-2通路相关蛋白的影响。按实验分组将细胞接种于6孔板中,药物处理后提取细胞总蛋白,利用Western blot技术检测信号通路相关蛋白(PDGFRβ、PI3K、 Akt及Erk)蛋白表达或磷酸化水平。结果1.卡维地洛可抑制HSCs增殖。CCK-8细胞增殖能力检测实验显示,卡维地洛明显抑制了HSCs的增殖能力,呈浓度依赖性。ⅠC50=28.42μM。2.卡维地洛抑制了HSCs的迁移能力和侵袭能力。划痕实验和侵袭实验结果分别显示,PDGF-BB可诱导HSCs迁移能力和侵袭能力增加,卡维地洛处理后的HSCs迁移能力和侵袭能力随浓度增加逐渐减弱。3.卡维地洛抑制了PDGF-BB诱导的HSC纤维化作用。Real-time PCR和Western Blot结果显示,PDGF-BB可诱导HSCs 中 Col 1和FN的mRNA表达水平增高,FN和α-SMA的蛋白表达水平增高,卡维地洛处理可抑制这种增高。4. PDGFR/Akt通路介导了卡维地洛的抗纤维化作用。Western Blot结果显示,PDGF-BB可诱导HSCs中PDGFRβ (Tyr751)和Akt磷酸化增高,卡维地洛可抑制这种增高,PDGF-BB可轻度增高P13K表达,但卡维地洛对PI3K表达无明显影响。结论1.卡维地洛可抑制HSCs增殖。2.卡维地洛可抑制PDGF-BB诱导的HSCs的迁移、侵袭作用。3.卡维地洛可抑制PDGF-BB诱导的HSCs纤维化作用。4.卡维地洛对HSCs纤维化作用的影响可能通过PDGFR/Akt通路发挥作用。第二部分卡维地洛通过抗血管形成对肝纤维化的作用研究目的观察卡维地洛对脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能及血管形成作用的影响,并进一步研究其内在机制,同时观察卡维地洛对其鞘氨醇激酶脂酶1(SK1)表达的影响。方法1.CCK8检测细胞增殖水平按实验设计的分组(空白对照,阳性对照以及药物处理)情况,将细胞分入96-孔培养板培养。24h后进行CCK8分析,检测卡维地洛对HUVEC增殖的影响。2.流式细胞仪检测细胞周期。按实验分组将细胞接种于培养皿中,不同浓度的卡维地洛处理后胰酶(无EDTA)消化,冰PBS洗细胞,预冷乙醇固定细胞,溴化乙锭(PI)及RNase A避光染色后使用流式细胞仪进行分析。3.划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力按实验分组将细胞接种于6孔板中,200μL灭菌移液器枪头沿培养板划直线,加入VEGF及浓度梯度的卡维地洛处理24h后图像采集。按实验分组将细胞接种于铺有基质胶的Transwell、室上室,同时加入不同浓度的卡维地洛,下室加入VEGF。继续培养24小时后取出上室,剪下底部膜染色,光学显微镜下图像采集并计数。4.成管实验进行血管形成能力检测。按实验分组将细胞接种于铺好基质胶的96孔板,加入VEGF和浓度梯度的卡维地洛处理8-12h后采集图像。5. Western blot检验信号通路关键蛋白变化按实验分组将细胞接种于6孔板中,加入不同浓度的卡维地洛和VEGF处理后,提取细胞蛋白,利用、Vestern blot实验检测VEGFR-2、 Erk和Src蛋白磷酸化水平的改变。6. Real-time PCR 及 Western blot检验细胞SK1表达水平不同浓度的卡维地洛和VEGF处理后的细胞分别提取RNA及总蛋白,分别利用real-time PCR及Western blot检测卡维地洛对HUVEC中SK1的mRN A及蛋白表达水平的影响。结果1.卡维地洛可抑制HUVECs增殖。CCK-8细胞增殖能力检测实验显示,卡维地洛明显抑制了HUVECs的增殖能力,呈浓度依赖性。IC50=38.5μM。2.卡维地洛诱导了HUVECs的G1期停滞。流式细胞仪检测细胞周期结果显示：卡维地洛处理HUVECs后造成细胞G0/G1期延长(P<0.05 vs control),伴随S和M期的缩短。3.卡维地洛抑制了 HUVECs的迁移能力和侵袭能力。划痕实验和侵袭实验结果分别显示,VEGF可诱导HUVEC迁移能力和侵袭能力增加,卡维地洛处理后的HUVECs迁移能力和侵袭能力随浓度增加逐渐减弱。4.卡维地洛抑制了HUVECs血管形成能力。成管实验结果显示,、VEGF可诱导HUVECs于基质胶形成丰富管样结构,卡维地洛处理后的HUVECs成管能力随浓度增加逐渐减弱。5. VEGFR2/Src/ERK通路介导了卡维地洛的抗血管形成作用。Western Blot结果显示,VEGF可诱导VEGFR-2.ERK1/2 和 Src磷酸化增高,卡维地洛可抑制这种磷酸化程度的增高,Src激酶抑制剂(PP2)亦可抑制VEGF诱导的ERK1/2磷酸化。6.卡维地洛抑制了HUVECs的SK1表达。结果显示,VEGF诱导了HUVECs 中 SKI mRNA和蛋白水平的增高,卡维地洛处理后抑制了这种增高。结论1.卡维地洛可抑制HUVECs的增殖并诱导细胞周期停滞。2.卡维地洛可抑制VEGF诱导的HUVECs的迁移、侵袭和血管形成作用。3. VEGFR2/Src/ERK通路可能是卡维地洛的抗血管形成作用机制。4.卡维地洛抑制了HUVECs的SK1表达,可能从而抑制了内皮细胞对肝星状细胞的旁分泌作用。第三部分外泌体对肝星状细胞迁移能力的作用及机制研究目的研究来源于内皮细胞的外泌体是否可通过旁分泌作用于肝星状细胞,并影响其生物学功能。方法1.小鼠肝窦内皮细胞(LEC)的分离肝组织经灌注、收集、切开、剪碎、胶原酶缓冲液消化、与免疫磁珠结合、分离细胞后,种入含Ⅰ型胶原的培养皿。标准细胞培养条件培养。2.慢病毒转染产生稳定细胞系设计SK1显性失活突变(D81A)模板和SK1组成性激活突变(G113 A)模板。利用293T细胞产生慢病毒并转导入TSEC形成表达SK1野生型、SKI D81A突变和G113A突变的稳定细胞系。并分别从此三种细胞系的条件培养基中提取外泌体。3.外泌体纯化分别从血清和细胞培养上清中采用梯度离心法提取外泌体。采用WesternBlot、纳米颗粒追踪分析和电镜免疫金标记对外泌体进行鉴定。4.免疫荧光、共聚焦显微镜和图片定量4%多聚甲醛固定细胞,封闭,一抗孵育,洗片,二抗孵育,洗片,DAPI染核,洗片,封片液封片后置于荧光共聚焦显微镜下进行图像采集。5.纳米颗粒追踪分析外泌体样本以4-8×108个/mL浓度装载入NanoSight NS300设备,记录3段30s视频,进而分析囊泡的外观、大小和密度进行。6. Western Blot 及 Real-time PCR常规方法进行Western Blot及Real-time PCR检测。7. Transwell迁移实验通过Transwell小室检测外泌体及各类成分对HSC迁移能力的影响。8.透射电子显微镜和免疫金标样本经多聚甲醛固定、载入电镜网格、洗涤、一抗孵育、洗涤、金标二抗孵育洗涤、戊二醛固定、染色后使用透射电镜观察并采集图像。9.扫描电子显微镜样本经固定、洗涤、再固定、脱水、干燥、封片、溅射镀膜后使用扫描电镜观察并采集图像。10.生物素分析法检测细胞膜表面整合素活性外泌体处理细胞后,使用生物素对细胞表面蛋白进行标记,收集裂解液并与蛋白G琼脂糖珠结合后获得蛋白样本,常规Western Blot法检测目的蛋白。11.动物处理C57BL/6小鼠接受CC14腹腔注射或胆总管结扎手术建立肝纤维化模型。同时根据具体需要给予相应药物处理。12.天狼猩红染色肝组织石蜡切片脱蜡后使用天狼猩红+固绿染液染色,脱水封片后光镜下图像采集。结果1.我们提取的外泌体特点为：直径80-100nm,杯状双层膜形态,CD81、TfR和CD63免疫金染色阳性,WB检测到T SG101、TfR、CD63等特征性外泌体标志物。微阵列分析显示成纤维细胞生长因子(FGF)-2会诱导EC中SK1mRNA水平增高2.4倍。2.外泌体处理HSC后会同时造成AKT磷酸化8.3倍增高和迁移的2.5倍增加。SK1过表达EC细胞系来源的外泌体会使HSC迁移增高3.2倍。显性失活SK1细胞的外泌体不能诱导HSC迁移。3. Western Blot和透射电镜发现外泌体表达基质蛋白和整合素配体FN。通过CD20中和抗体或RGD肽阻断FN与整合素相互作用后,外泌体诱导的HSCAKT磷酸化和迁移降低。4.通过发动蛋白siRNA转染、发动蛋白GTP酶显性失活结构DynK44A转染或药理学抑制剂Dynasore抑制内吞作用后,外泌体诱导的AKT磷酸化明显降低。外泌体内吞入细胞后,先出现在早期内吞体,随后出现在溶酶体区域。5.肝纤维化模型小鼠血清来源外泌体中SK1水平增高,肝硬化患者肝组织中SKI mRNA水平有2.5倍增高。6. S1PR2抑制可保护CC14引起的小鼠肝纤维化。结论内皮细胞来源的含SK1的外泌体可通过依赖FN-整合素的粘附和依赖发动蛋白的内吞调节HSC的信号转导和迁移。外泌体可能是将来减轻肝纤维化病理进程新靶点