开发有效的免疫性避孕疫苗可能成为控制人口过度增长的理想措施。其主要机理是应用在受精过程中发挥关键作用的分子作为靶抗原用于免疫目标人群使之产生相应免疫反应，从而阻断受精过程，达到避孕目的。近年来的研究显示基于精子抗原开发避孕疫苗是极具现实可行性和应用前景的避孕途径。 精子与卵透明带和与卵子质膜的相互作用是受精过程的关键环节，阻断精-卵作用的这两个环节成为免疫性避孕研究的主要着眼点。精子表面蛋白受精素β亚单位（F_β）定位于精-卵融合的特定区域即精子头部表面赤道区域或头后部区域，它作为一种细胞粘附分子介导了哺乳动物精子与卵ZP的结合及精-卵膜的结合和融合。Cyritestin是一种精子顶体膜蛋白，在IVF条件下，应用其去整合素结构域的合成多肽或单抗可明显抑制精-卵的结合和融合。丧失Cyritestin基因的纯合子雄鼠无生育能力，且缺乏Cyritestin的精子不能与卵ZP结合。可见F_β和Cyritestin在精子与ZP结合及精-卵膜的结合和融合过程中均发挥重要作用，是具有重要潜在价值的睾丸特异性疫苗靶抗原。但国内外至今未见应用可口服的沙门氏菌疫苗株表达该两种蛋白作为疫苗靶抗原诱发免疫性避孕的研究报道。 本研究首次将F_β和Cyritestin作为靶抗原，应用基因重组技术将编码鼠精子F_β蛋白胞外区（含去整合素样结构域）和编码成熟Cyritestin蛋白的cDNA序列插入表达载体pYA3149，并利用沙门氏菌染色体/质粒平衡致死体系，成功地构建了能在沙门氏伤寒杆菌减毒疫苗株X4550、X4632中稳定传代并表达的重组质粒pFEC、pCFL。将分别表达两种精子抗原的四种重组菌口服免疫雌雄小鼠，观察了重组菌在小鼠体内传代的稳定性，雌鼠血清、生殖道内的抗体滴度变化和对其生殖能力的影响，以及雄鼠睾丸、附睾的病理改变。同时为进一步了解精子抗原F产 Cyritestin在受精过程中的重要作用，应用体外受精技术和免疫细胞化学技术分别观察了F，、Cyritestin单抗、抗血清对精平相互作用的影响及该两种精子抗原的特异性定位。本研究的主要结果和结论如下： 一、采用PCR方法，以含F吓DNA的质粒为模板，扩增其胞外区CDNA序列，将该段基因插入表达载体 pYA3 149，构建了重组质粒 pFEC；应用酶切方法从含有Cyritestin cDNA序列的质粒中获得编码成熟Cyritestin蛋白的全基因序列，同法插入上述表达载体，构建了重组质粒pCFL。 二、首次分别将含有鼠精子抗原F卜Cyritestin的两种重组表达质粒pFEC、pCFL转入两种减毒沙门 氏菌疫苗株X4632和 X4550中，成功筛选了四种重组疫苗株。Western blot证实四种重组菌均可成功表达鼠精子 F卜Cyritestin蛋白，其分子量分别为 30KDa和 55KDa大小，且与鼠、人睾丸特异性天然F卜Cyritestin蛋白的抗原性具有相似性。 三、应用四种重组沙门氏菌疫苗株分别口服兔疫雌性昆明小鼠后，显示均可较稳定地侵入并定居于Peyer’s结，诱导小鼠在产生抗LPS抗体的同时产生抗重组抗原的高滴度血清IgG抗体，其滴度水平从免疫后2周开始逐渐升高，12周时最高可达1：7600；而且可诱导产生阴道粘膜分泌性抗重组抗原屹A抗体，其滴度水平从免疫后 4周开始逐渐升高，12周时最高可达1：35O：＊4632菌株定居于深部组织的能力较＊巧SO菌株明显减弱，但仍可激发与后者相似水平的抗体反应。同时重组疫苗株可诱导雌鼠产生显著免疫性避孕效应，实验组雌鼠妊娠率平均降低30＊0％，每胎产仔数平均降低64．76J0．480。其中以重组X4550（pCFL）组小鼠妊娠率及每胎产仔量降低最为显著，分别为 40％和 70．48％。初步证明以 F。和 Cyritestin为抗原，沙门氏菌为载体的重组疫苗具有显著免疫性避孕效应。目前的疫苗株尚未达到完全避孕的效果，但为研制新型避孕基因疫苗奠定了基础。 四、应用四种重组沙门氏菌疫苗株分别口服兔疫雄性昆明小鼠后，仅部分雄鼠擎丸组织曲细精管管腔中可见散在淋巴细胞浸润，无典型自体免疫性睾丸炎表现，大部分小鼠附睾管腔内精子数无明显减少。表明表 x达精子抗原Fg、Cyritestin的减毒沙门氏菌疫苗株所诱导的自体兔疫效应对机体晕丸附睾组织影响轻微，对其生殖细胞的发育影响不大，具有良好的安全性，支持采用该类减毒沙门氏菌疫茵株用于开发避孕疫苗。 五、F。单抗及抗血清预孵育不同浓度精子后，可使精4的结合指数平均降低了 56．050和 53．260，受精指数平均降低了 52．180和 57．890，受精率平均降低了 41．56％和 47．39％；Cyritestin单抗及抗血清预孵育不同浓度精子后，可使精平的结合指数平均降低了 60．33％和 56二0％，受精指数平均降低了 66．90％和 59．70％，受精率平均降低了 57．41％和45．79％；两者单抗及抗血清均可显著降低体外精柳的结合和融合，从而降低卵细胞的受精率。其中以Cyritestin单抗的作用最为显著。而且F卜Cyritestin均特异性定位于顶体反应前后精子头?