第一部分：　　 目的:　　 1．观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位—p55PIK氨基端24个氨基酸(N24)对人角质形成细胞株—HaCaT细胞增殖的影响。　　 2．观察不同浓度以及不同时间脂多糖刺激下HaCaT细胞释放炎性因子TNF-α的变化。　　 3．观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位p55PIK及其氨基端24个氨基酸对脂多糖刺激HaCaT细胞释放细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的影响,为临床治疗工作提供理论依据。　　 方法:　　 利用分子生物学手段构建并表达纯化了含有PI3K-p55PIK-N末端24个氨基酸的TAT-N24融合多肽、腺病毒AD-N24-GFP和含有PI3K-p55PIK的腺病毒AD-p55PIK-GFP,能够高效的携带N24或p55PIK进入细胞内。以人角质形成细胞株—HaCaT细胞为研究对象，以脂多糖(lipopolysaccharides LPS)刺激为主要诱导方式，探索N24对HaCaT细胞增殖的影响，应用CFDA标记法检测细胞增殖情况；探索LPS的最佳刺激时间和刺激浓度，采用ELISA法、ReAltime-PCR法检测N24及p55PIK干预下TNF-α、IL-6和IL-8蛋白水平及mRNA水平的变化。　　 结果:　　 1．成功构建并表达纯化了TAT-N24融合多肽和腺病毒AD-N24-GFP,AD-p55PIK-GFP；TAT-N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程于G0/G1期,S期和G2/M期细胞减少, TAT-N24组各期细胞分布为:G0/G1期(80.37±1.09)％,S期(7.81±1.97)％,G2/M期(11.82±1.71)％,而对照多肽组各期细胞分布为：G0/G1期(58.54±2.06)％, S期(26.34±1.69)％, G2/M期(15.12±1.91)％,空白对照组各期细胞分布为：G0/G1期(60.14±2.06)％, S期(25.32±1.78)％, G2/M期(14.34±1.39)％，组间有显著性差异（p<0.05）; BrdU阳性细胞比例显示：TAT-N24组R2为：(8.37±2.06)％,对照多肽组R2为：(28.14±4.69)％, 空白对照组R2为：(26.73±3.58)％,提示TAT-N24能有效抑制HaCaT细胞的DNA合成; CFDA检测显示TAT-N24组增殖指数(PI)为：30.75±3.66,对照多肽组增殖指数(PI)为：47.81±5.66,空白对照组增殖指数(PI)为：50.16±5.33,有显著差异（p<0.05）提示TAT-N24能有效抑制HaCaT细胞的增殖。　　 2．成功构建LPS刺激下HaCaT细胞释放炎性因子的模型。正常状态下的HaCaT细胞有TNF-α、IL-6和IL-8的自发性分泌；LPS刺激后的HaCaT细胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌量明显增加这与银屑病患者皮损中细胞因子的变化非常相似。ELISA法确认LPS最佳的刺激浓度和刺激时间，使HaCaT细胞释放炎性因子TNF-α水平达到最高。　　 3．TAT-N24作用于HaCaT细胞后其TNF-α的分泌量有一定的增加,它们可能参与了对正常皮肤的炎性刺激作用,一定浓度TAT-N24可有效抑制LPS刺激HaCaT细胞释放TNF-α、IL-6和IL-8。ELISA检测结果显示：相对于LPS刺激组，TAT-N24干预组的细胞上清内TNF-α、IL-6和IL-8的浓度分别由208.06±30.18pg/ml、86.4±9.78pg/ml和260.59±54.05pg/ml下降至121.78±22.26pg/ml、53.18±7.36pg/ml和125.08±35.17 pg/ml。ReAltime-PCR结果显示：正常HaCaT细胞可以分泌一定程度的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8。内毒素（LPS）刺激HaCaT细胞后，炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的释放增加，加入TAT-N24干预后，上述三种促炎因子的表达降低。而AD-N24-GFP也可以抑制LPS刺激HaCaT细胞释放炎性因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的表达，其作用和TAT-N24功能类似; AD-p55PIK-GFP自身也可以导致炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的释放增加，加入LPS刺激后，炎性因子的释放增加，与空白对照组及无AD-p55PIK-GFP干预下LPS刺激组比较，其差异具有统计学意义。　　 4．ReAltime-PCR法检测结果显示：正常HaCaT细胞有一定程度的TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表达， LPS刺激后，上述三种炎性因子有不同程度的升高。 HaCaT细胞经TAT-N24和AD-N24-GFP预先处理过后，LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8相对于未预先处理组mRNA水平表达降低；感染AD-p55PIK-GFP后，HaCaT细胞在LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平表达升高。　　 第二部分:　　 目的：探讨N24及p55PIK在HaCaT细胞内对TLR2、TLR4及其信号转导通路的调控机制。　　 方法：免疫组化检测NF-κB P65在HaCaT细胞内的表达情况；免疫荧光激光共聚焦显微镜分析NF-κB P65在HaCaT细胞内的转位表达情况；Western Bloting检测分析AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP干预后，LPS刺激下HaCaT细胞内TLRs信号通路蛋白的表达情况。　　 结果：　　 1、免疫细胞化学结果提示正常HaCaT细胞内NF-ＫB P65蛋白主要表达在细胞浆内，低染，LPS刺激后P65蛋白转位入核，在核内表达增加，高染; 感染AD-N24-GFP后NF-κB P65在细胞核内的表达降低。　　 2、免疫荧光后激光共聚焦显微镜分析结果显示正常HaCaT细胞内NF-κB P65蛋白主要表达在细胞浆内，LPS刺激后NF-κB P65转位入核，在核内表达增加;感染AD-N24-GFP后NF-κB P65蛋白在核内的表达降低。　　 3、Western Bloting结果提示 LPS刺激下HaCaT细胞内TLRS通路中各蛋白均有不同程度的改变，TLR2、TLR4表达增加，它们在4小时内达到高峰，随后逐渐降低，但到24小时仍然高于正常细胞表达水平；感染AD-N24-GFP后，其表达情况未见明显变化，感染AD-p55PIK-GFP后TLR2及TLR4表达均增加；MyD88蛋白表达随LPS刺激时间的增加而增加，到8小时达到最高点，然后逐渐下降但24小时内仍高于正常水平，感染AD-N24-GFP后MyD88表达降低，而感染AD-p55PIK-GFP其表达增加；磷酸化Akt(p-Akt)表达随LPS刺激时间增加而增加，在2小时达到最高峰，以后逐渐降低，到24小时已经基本恢复到正常水平，感染AD-N24-GFP后其表达情况为未见明显改变；感染AD-p55PIK-GFP后p-Akt表达增加；ERKs从30分钟起磷酸化激活增强(P<0.05),4小时达高峰(P<0.05),其后逐渐下降,但直至24小时仍显著高于基础水平(P<0.05)。JNK/SAPK、p38亦有与ERKs磷酸化激活相同的变化趋势,所不同的是,JNK/SAPK磷酸化在4h高峰值以后迅速下降(P<0.05), 至24小时已经回复到基础水平。P38磷酸化在4h高峰后迅速下降(P<0.05),但24小时仍略高于基础水平(图2)。感染AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP后其表达情况为未见明显改变；IκB-α于LPS刺激后30分钟出现表达降低，到4小时达到最低点，到16小时开始逐步恢复，但到24小时仍然低于正常水平。感染AD-N24-GFP后，IκB-α表达相对于LPS刺激组增加；感染AD-p55PIKP后，IκB-α表达相对于LPS刺激组表达未见明显变化。　　 结论：AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP通过干预TLRs/MyD88介导的信号通路来影响LPS刺激下HaCaT细胞释放炎性因子的变化。