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背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病机制主要涉及胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症、凋亡等过程。其中炎症和氧化应激可促进NAFLD的发生发展。有研究表明硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的上调与肝脏脂代谢紊乱、氧化应激和炎症的发生密切相关。丹酚酸A(Salvianolic acida,SalA)是一种多酚类化合物,具有抗脂质堆积、抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。已有文献证实多酚类化合物能通过调控TXNIP进而靶向下游因子发挥保护作用。NOD-样受体家族蛋白-3(NOD-likereceptor 3,NLRP3)与碳水化合物反应元件蛋白(Carbohydrate response element-bindingprotein,ChREBP)作为TXNIP的下游作用因子,在脂代谢紊乱、氧化应激及炎症等肝脏损伤中发挥重要的作用。但是TXNIP-NLRP3和TXNIP-ChREBP通路在高脂饮食(High fat diet,HFD)所致的大鼠NAFLD中的作用,以及SalA是否通过调控这两条通路进而对NAFLD发挥保护作用目前尚未见报道。目的:研究TXNIP-NLRP3和TXNIP-ChREBP通路在HFD所致的大鼠NAFLD中的作用;探讨SalA对NAFLD的保护作用及机制。方法:1、丹酚酸A对HFD所致NAFLD的保护作用研究将50只健康成年的雄性SD大鼠(180-220g)随机分为以下5组:空白对照组;空白对照+SalA给药组(16mg/kg/d);HFD组;HFD+低剂量SalA给药组(8mg/kg/d);HFD+高剂量SalA给药组(16mg/kg/d)。给药方法为灌胃,高脂饲料喂养10周,制备大鼠NAFLD模型。10周后腹主动脉采集血液,分离大鼠肝脏组织标本。检测血清中谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、游离脂肪酸(Non-esterified fatty acid,NEFA)、白介素 6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子 α(Tumor necrosis α,TNF-α)的活性。肝脏组织标本称重并拍照后,检测肝组织中TG、TC、NEFA、过氧化氢(H202)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性。采用HE染色检查肝脏病理改变。采用Western Blot法检测肝组织TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、ChREBP、FAS 蛋白水平。采用 qRT-PCR 法检测肝组织TXNIP和NLRP3的mRNA水平。2、丹酚酸A对PA诱导HepG2细胞损伤的保护作用及相关机制研究(1)丹酚酸A对PA诱导的HepG2细胞损伤的保护作用HepG2细胞随机分成五组:空白对照组;PA组;低、中、高剂量丹酚酸A预处理组(0.2μM、2μM、20μM)。药物与细胞共孵6h后,加入0.5mMPA孵育24h造模,MTT实验测定细胞存活率。HepG2细胞随机分为三组:空白对照组;PA组;PA+SalA预处理组。SalA(20μM)与细胞共孵6h后,用PA(0.5mM)诱导24h造模。检测细胞上清液中H202水平,荧光探针法测定细胞内ROS水平,尼罗红染色检测HepG2细胞内脂质积累的情况,ELISA检测炎症细胞因子释放情况。(2)探讨TXNIP-NLRP3和TXNIP-ChREBP通路在PA诱导的HepG2细胞损伤中作用及丹酚酸A的保护作用机制。HepG2细胞随机分为4组:空白对照组;PA组;PA+SalA(20μM)给药组;PA+RES(10μM)给药组。药物与细胞共同孵育6h后,用PA(0.5mM)诱导24h造模。Western Blot 法检测细胞内 TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 蛋白表达水平。HepG2细胞随机分为五组:空白对照组;PA组;PA+SalA(20μM)给药组;PA+BAY 11-7082(15μM)预处理组;PA+SalA(20μM)+BAY 11-7082(15μM)预处理组。BAY 11-7082是NLRP3炎性体特异性的抑制剂。丹酚酸A或BAY 11-7082与细胞共同孵育6h后,用PA(0.5mM)诱导24h造模。Western Blot法检测细胞内TXNIP、NLRP3、IL-1β蛋白表达水平。HepG2细胞随机分为四组:阴性对照组;阴性对照+SalA(20μM)组;转染TXNIPsiRNA 组;转染 TXNIPsiRNA+SalA(20μM)组。转染后,SalA 给药作用6h后提取细胞蛋白。Western Blot法检测细胞内TXNIP及NLRP3的蛋白表达情况。HepG2细胞随机分为五组:阴性对照组;阴性对照+PA组;阴性对照+PA+SalA(20μM)组;PA+转染 TXNIPsiRNA 组;PA+转染 TXNIPsiRNA+SalA(20μM)组。转染后,丹酚酸A给药作用6h后,用PA(0.5mM)诱导24h,分别提取细胞全蛋白、胞浆及胞核蛋白。Western Blot法检测细胞内TXNIP、NLRP3、IL-1β、FAS的蛋白表达情况以及胞浆和胞核内ChREBP的蛋白表达情况。ELISA检测炎症细胞因子释放情况。结果:实验结果显示,HFD组大鼠肝脏呈中度或重度脂肪变,肝小叶结构紊乱,肝细胞肿胀变形,胞浆内存在大量脂肪空泡且大小不等,炎性细胞浸润明显增加。血清ALT、AST水平增加。而SalA处理能明显改善HFD所致的大鼠肝损伤。一方面,SaIA可显著减轻脂质堆积如大鼠血清和肝组织中TG、TC、NEFA水平均明显下降。另一方面,SaIA能显著抑制氧化应激和炎症如肝组织H202及血清炎症细胞因子TNF-α、IL-6的水平显著下降,同时使大鼠肝组织中的MDA水平下降、SOD含量明显上升。SalA显著下调了 TXNIP的表达且能抑制NLRP3炎性体的活化和ChREBP的核易位。细胞实验中,TXNIP基因被干扰后可抑制NLRP3炎性体活化、炎症细胞因子释放、ChREBP的核质易位及脂生成基因FAS的上调,同时SalA对NLRP3炎性体和ChREBP核易位的抑制作用减弱甚至消失,即SalA对NLRP3和ChREBP的调控至少是通过TXNIP实现的。NLRP3炎性体活化被BAY 11-7082抑制后可下调NLRP3和IL-1β的蛋白表达,而TXNIP的蛋白表达无明显变化,进一步表明TXNIP在上游调控NLRP3炎性体活化。以上结果表明丹酚酸A对大鼠NAFLD具有保护作用,并且这种作用是通过调控TXNIP-NLRP3和TXNIP-ChREBP通路实现的。结论:1、TXNIP-NLRP3和TXNIP-ChREBP信号通路在大鼠非酒精性脂肪性肝病中起关键性作用;2、在HFD/PA诱导的NAFLD损伤中,丹酚酸A通过TXNIP调控NLRP3炎性体活化和ChREBP核质易位,从而发挥抗非酒精性脂肪性肝病的保护作用。